预防NSCLC脊柱转移的潜在新靶点

肺癌是全球第二大常见癌症，也是全球男性和女性癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌 (NSCLC) 是最常见的肺癌类型，占所有病例的 80% 以上。在晚期NSCLC患者中，超过70% 的患者发生骨转移，其中80%发生在脊柱。

当发生脊柱转移时，常导致骨质破坏、病理性骨折、严重的骨痛和神经功能缺损。虽然化疗、放疗、手术切除等外科手术和综合治疗可以降低 NSCLC 脊柱转移的发病率，但这些治疗往往不能显著提高总生存率。因此，迫切需要研究 NSCLC 衍生的脊柱转移的机制，并制定预防或早期治疗NSCLC脊柱转移的策略。

肿瘤转移涉及一系列复杂的生物学过程：肿瘤细胞从实体瘤中脱落；脱落细胞进入循环系统并形成循环肿瘤细胞（CTCs）；与其他肿瘤细胞、血小板或其他细胞聚集形成CTC簇；到达远处器官并穿透局部血管；以及原位定植和周围组织的相关破坏。这些过程依赖于几种肿瘤调节因子，包括趋化因子、细胞因子和粘附分子，它们介导血管生成、肿瘤细胞存活和侵袭。

脊椎骨的红骨髓具有特殊的血窦结构，其中含有多种细胞因子、酶和激素，尤其是趋化因子。趋化因子是一个与结构相关的小的分泌细胞因子家族，在炎症和免疫中起着至关重要的作用。近年来，趋化因子已被证明参与调节各种肿瘤进展过程，如白细胞招募、肿瘤细胞迁移和增殖。

在这些趋化因子中，C-X3-C 基序趋化因子配体 1 (CX3CL1) 被认为是肿瘤转移过程中必不可少的调节因子。有趣的是，CX3CL1在脊椎骨的红骨髓中比在肢骨中更丰富，这可能是脊柱转移瘤的原因。尽管 CX3CL1 可能在脊柱肿瘤进展中发挥作用，但 CX3CL1 对 NSCLC 脊柱转移的几个方面的影响，特别是对 CTC 外渗到脊椎松质骨的影响，这是肿瘤脊柱转移的第一步和关键步骤，目前仍然尚不清楚。

以此为基点，上海复旦大学中山医院骨科、胸外科以及美国密西西比州的JMS 烧伤和重建中心的多位研究学者进行了相关研究，在 Theranostics 上发表了题为《Vertebral-specific activation of the CX3CL1/ICAM-1 signaling network mediates non-small-cell lung cancer spinal metastasis by engaging tumor cell-vertebral bone marrow endothelial cell interactions》的研究论文。

因此，实验假设脊柱中CX3CL1表达的增加促进了循环NSCLC细胞的粘附和跨内皮迁移，并引发了NSCLC脊柱转移。

为了验证这一假设，实验检测了脊椎松质骨和脊椎骨髓内皮细胞 (VBMECs) 中 CX3CL1 的含量，确定CX3CL1 是否影响循环 NSCLC 细胞的生物学行为，如粘附、跨内皮迁移和侵袭，并探讨了其潜在机制。

最后，实验研究了阻断 CX3CL1 介导的信号传导是否可以限制转移并延长体内心内模型的存活期。

本研究的结果证明，CX3CL1促进了NSCLC细胞向脊椎松质骨的循环外渗，并突出了新的信号通路，为进一步研究NSCLC脊柱转移的预防或早期治疗策略提供了依据。

细胞粘附试验

采用平行平板流动室灌注系统模拟脊椎血窦血流。在中间腔室底部植入单层VBMECs作为平行平板流动腔室的固定相，以2',7'-bis-(2-carboxyethyl)5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester 标记的肿瘤细胞为流动相，密度为5 × 105/mL，无血清培养基。加入浓度为300 × 109 pl/L的血小板(pl)。在通道中心以1000 s-1的壁切变速率灌注细胞2 min(用注射泵以0.3 mL/min的流速将血液模拟物推入平行平板流室)。细胞流经内皮细胞固定相后，将非粘附的肿瘤细胞洗去，在荧光显微镜下计数贴壁荧光肿瘤细胞数量。

细胞共培养

Transwell上腔室预涂有Matrigel。在血清过夜后，将对照A549、shCX3CR1-A549、对照H1975或shCX3CR1-H1975细胞以20,000个细胞的密度接种到含有100 µL 条件培养液的上腔室，培养基为对照或敲除CX3CL1(CX3CL1-KD)的VBMECs，用10%的胎牛血清，培养6天。此外，由指定的A549或H1975细胞和VBMEC培养基组成的培养系统用AKT抑制剂MK-2206 2HCI (3 µM) 或PI3K抑制剂LY294002 (20 µM) 处理。在显微镜下测定细胞数。每孔中随机选取5个区域，通过计数染色细胞数量来定量分析。

VBMECs 通过 CX3CL1 信号介导的 PI3K/AKT 通路激活增强 NSCLC 细胞的侵袭

作为一种趋化因子，CX3CL1 已被证明可以促进癌细胞的侵袭。为了研究 CX3CL1 在 VBMECs 中的表达增加是否通过加速细胞侵袭来促进 NSCLC 脊柱转移，实验将A549细胞与VBMECs条件培养液一起培养，使用Transwell实验来量化NSCLC细胞的侵袭。

与对照相比，在条件培养液中生长的 A549 细胞的侵袭能力提高了约 3 倍；与对照组相比，肿瘤细胞的侵袭性增加了3 倍（图1 B-C）。VBMECs 中 CX3CL1 的基因消融最小化了VBMECs导致的A549细胞侵袭增加（图1 A-C，P< 0.01)。

此外，在A549细胞中沉默CX3CR1 (CX3CL1的唯一受体)，显著降低了VBMEC诱导的细胞侵袭(P < 0.01)，表明CX3CL1/CX3CR1功能性地介导了VBMEC对NSCLC细胞侵袭的影响。这些结果表明 VBMECs 通过 CX3CL1 依赖性信号通路促进 NSCLC 细胞侵袭。

为了研究CX3CL1介导的NSCLC细胞侵袭是否通过上皮-间充质转化 (EMT) 发生，实验检测了在VBMECs条件培养液培养后A549细胞中EMT标记物的表达水平。然后还分析了几种基质金属蛋白酶 (MMPs) 的表达，已知这些蛋白酶参与基质降解，而基质降解是细胞侵袭的重要组成部分。

结果发现，VBMECs 通过 CX3CL1 依赖性促进 EMT 和 MMP 介导的基质降解来上调 NSCLC 细胞侵袭（图 1 D）。

此外，实验检测了 PI3K 和 AKT 的表达水平。与VBMECs条件培养液共培养有效促进A549细胞PI3K和AKT磷酸化，PI3K和AKT总表达水平无明显变化，表明PI3K和AKT磷酸化参与VBMEC介导的促进NSCLC细胞的侵袭能力（图1 E)。

为了证实PI3K/AKT通路在VBMECs调控的NSCLC细胞侵袭中的作用，实验使用了PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂MK-2206 2HCI。

有趣的是，与条件培养液处理的对照组相比，LY294002 和 MK-2206 2HCI 处理的 A549 细胞显著抑制了侵袭能力，逆转了 VBMECs 引起的变化（图1 F-G）。蛋白质印迹分析表明，LY294002 或 MK-2206 2HCI 恢复了条件培养液处理的 A549 细胞中降低的 钙黏蛋白表达，而 LY294002 或 MK-2206 2HCI 处理可降低Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白的上调（图1 H）。

总体而言，这些数据表明，VBMECs 通过以 CX3CL1/CX3CR1 依赖性方式激活 PI3K/AKT 通路，赋予 NSCLC 细胞侵袭优势。

图1 VBMECs 通过 CX3CL1 信号介导的 PI3K/AKT 通路激活增强了 NSCLC 细胞的侵袭。

CX3CL1 通过ICAM-1 依赖性激活Src/GEF-H1 通路增加 VBMECs 的通透性，从而增强 NSCLC 细胞的跨内皮迁移

跨内皮迁移是肿瘤转移的关键步骤，因此，实验研究了 CX3CL1 对 NSCLC 细胞跨内皮迁移的影响（图2 A）。如图2 C和图3 B，NSCLC细胞通过CX3CL1- KD VBMEC屏障的细胞数量明显低于通过对照组VBMEC屏障的细胞数量，因此NSCLC细胞的跨内皮迁移需要CX3CL1。

此外，VBMECs 中的 ICAM-1 过表达挽救了 CX3CL1-KD 抑制 NSCLC 细胞跨内皮迁移的有效性，表明 CX3CL1 介导的 NSCLC 细胞跨内皮迁移需要 ICAM-1 信号传导（图 2 B-C 和图 3 A-B）。

为了研究 CX3CL1 / ICAM-1 介导的 NSCLC 细胞跨内皮迁移的机制，使用 FITC 标记的跨内皮葡聚糖通量来检测单层内皮细胞通透性。如图2 D，CX3CL1基因切除显著抑制葡聚糖的转运，而ICAM-1的过表达显著挽救了CX3CL1切除降低经内皮细胞葡聚糖转运的功效。

蛋白质印迹分析表明，CX3CL1基因抑制显著降低了VBMECs中Rho 相关激酶1 (ROCK1) 的表达，降低了Ras Homolog Family Member A (RhoA)和myosin light chain (MLC) 的磷酸化水平，而 ICAM-1 过表达则逆转了这一变化。（图2 E 和图3 C）。

考虑到经内皮细胞的葡聚糖转运直接反映了VBMEC的通透性，而ROCK1、RhoA和MLC是调控细胞骨架的关键分子，我们认为CX3CL1可以通过以ICAM-1依赖性的方式有效上调VBMEC的通透性，从而导致NSCLC细胞的跨内皮迁移增加。

鉴于 CX3CL1 和 ICAM-1 并不直接调控 VBMECs 的通透性，应该有其他信号通路负责改变 VBMEC 通透性。如在所示图2的F-G和图3 D、F，ICAM-1的基因切除显著降低了Src的磷酸化和GEF-H1的表达，并降低了ROCK1、p-RhoA和p-MLC的水平。

此外，当使用Src信号通路激动剂三苯氧胺时，ICAM-1沉默诱导的ROCK1、p-RhoA和p-MLC水平的降低被显著逆转（图2 G和图3 F）。此外，ICAM-1-KD可抑制葡聚糖转运，这种效果被三苯氧胺逆转（图2 H）。此外，ICAM-1可显著降低肿瘤细胞的跨内皮迁移，使用三苯氧胺也可以逆转这种情况（图2 I 和图3 G）。

总的来说，CX3CL1 可以通过ICAM-1 依赖性激活Src/GEF-H1 通路，增加 VBMEC 的通透性，从而诱导 NSCLC 细胞的跨内皮迁移。

图2 CX3CL1/ICAM-1通过Src/GEF-H1途径增加VBMEC的通透性，从而增强NSCLC细胞的跨内皮迁移

图3

综上所述，该研究结果表明，脊椎骨中高表达的 CX3CL1 / ICAM-1 通过驱动循环 NSCLC 细胞和 VBMECs 之间的脊柱特异性恶性循环来促进 NSCLC 脊柱转移。

该循环基于 CX3CL1 / ICAM-1 介导的 NSCLC 细胞-VBMEC 的相互作用，从而增强肿瘤细胞的侵袭性和粘附性，改善VBMEC的通透性，并通过多种信号通路增加 NSCLC 细胞的跨内皮迁移。该研究中描述的机制可能为预防NSCLC脊柱转移提供潜在的新靶点。

参考文献：
Wang K, Jiang L, Hu A, Sun C, Zhou L, Huang Y, Chen Q, Dong J, Zhou X, Zhang F. Vertebral-specific activation of the CX3CL1/ICAM-1 signaling network mediates non-small-cell lung cancer spinal metastasis by engaging tumor cell-vertebral bone marrow endothelial cell interactions. Theranostics. 2021 Mar 4;11(10):4770-4789. doi: 10.7150/thno.54235. PMID: 33754027; PMCID: PMC7978319.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33754027/

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