剪切应力通过降低血管内皮细胞的质膜胆固醇来激活线粒体氧化磷酸化水平

血管内皮细胞 (ECs) 能够识别血液流动产生的剪切力，并将其转导为细胞内生物化学信号，从而引起细胞形态、功能和基因表达的变化等反应。这些 EC 反应在维持循环系统的稳态方面起着至关重要的作用。

迄今为止，许多研究阐明了 EC 机械转导的机制，并揭示了一个独特的特征：剪切应力几乎同时通过离子通道、受体和粘附蛋白等多种膜分子激活多种信号转导通路。

近年来，质膜本身在EC机械转导中起着重要的作用。EC质膜通过改变其物理性质(如流动性、粘度和脂质顺序)来快速响应剪切应力。

已知Ca 2+信号在 EC 机械转导中发挥关键作用 ( 12 )。ECs快速释放内源性三磷酸腺苷(ATP)以响应剪切应力，该ATP激活位于质膜上的嘌呤受体，这些嘌呤受体负责细胞外 Ca 2+流入和 Ca 2+从内质网释放。细胞质 Ca 2+的增加激活了多种 EC 功能。

胆固醇通过影响膜脂顺序、流动性、弯曲系数、厚度、硬度和双层压力分布，在决定质膜的机械性能方面起主导作用。例如，EC 质膜胆固醇的消耗会抑制剪切应力诱导的细胞外信号调节激酶的激活，而向 EC 质膜添加胆固醇可抑制剪切应力诱导的 VEGFRs 磷酸化。然而，质膜胆固醇在 EC 机械转导中的作用尚未完全阐明，部分原因是缺乏关于质膜胆固醇在EC剪切应力下表现的信息。

在过去十年中，domain 4 (D4) of perfringolysin O (PFO)，一种胆固醇结合毒素，作为胆固醇特异性分子传感器，已被广泛应用于细胞膜中胆固醇的检测和成像。

以此为起点，来自东京大学研究生院生物医学工程系的专家团队进行了更深层次的研究，在 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 上发表了题为《Shear stress activates mitochondrial oxidative phosphorylation by reducing plasma membrane cholesterol in vascular endothelial cells》的研究论文。

该团队以往的研究表明，线粒体在 ECs中剪切应力诱导的 ATP 释放和 Ca 2+信号传导中起重要作用。在剪切应力刺激下，ECs 迅速增加线粒体 ATP 的产生，触发 ATP 释放和随后的 Ca 2+信号传导。然而，作用于质膜的剪切应力影响 ECs 中线粒体氧化磷酸化的方式仍然未知。

在本研究中，对培养的人肺动脉内皮细胞(HPAECs)施加控制水平的剪切应力，并使用基于 D4 突变体的胆固醇生物传感器的荧光成像和流式细胞术检测质膜胆固醇的数量和分布的变化。

实验还使用生化测量来分析整个细胞和分离的质膜中胆固醇含量的变化。

此外，为了确定质膜胆固醇的变化是否影响线粒体氧化磷酸化，利用基于荧光共振能量转移(FRET)的ATP生物传感器实时成像，检测了线粒体ATP浓度的变化。

部分实验过程：

剪切应力导致质膜胆固醇的快速下降

当HPAECs在流体加载装置中承受15 dynes/cm2的剪应力15 min时，定位于质膜的EGFP-D4YDA和mCherry-D4YDA信号均显著下降。定量分析表明，剪切应力显着降低了质膜中两种探针的荧光强度。

这些发现表明，剪切应力降低了定位于内外质膜双分子层的胆固醇含量。

当剪切应力停止5分钟后，在mCherry-D4YDA图像中看到的下降的胆固醇水平回到了控制水平。mCherry-D4YDA实时成像显示，剪切应力开始后，内质膜胆固醇水平立即开始下降，剪切应力停止后，下降的胆固醇水平逐渐恢复。

这些发现表明，膜胆固醇的反应是快速且可逆的。

用 EGFP-D4 YDA 标记的HPAEC进行流式细胞术以量化其质膜外双分子层的胆固醇含量。胆固醇水平在剪切应力开始后迅速下降，在 10 分钟时达到最小值（约为静态控制值的60%），此后趋于稳定。剪切应力停止后，降低的胆固醇水平恢复到控制水平。

当 ECs 受到不同强度的剪切应力时，胆固醇水平在 0 到 10 dynes/cm2范围内以剂量依赖的方式下降；在10 dynes/cm2达到最小值后，它们保持在 15 dynes/cm2的相同水平。用胆固醇消耗剂 MβCD 处理细胞后，质膜胆固醇水平降低到对照组的一半以下。

剪切应力主要是在顶端质膜中降低了游离胆固醇和酯化胆固醇

从 HPAEC 中分别获得顶端和基底质膜，并通过生化方法测量每个膜中的胆固醇含量。15 dynes/cm2剪应力作用15 min后，顶端质膜的胆固醇含量显著下降，但基底质膜的胆固醇含量无明显下降。

这说明质膜胆固醇的降低主要发生在顶膜。

质膜不仅含有游离胆固醇，还含有酯化胆固醇。在用或不用酯酶处理的 ECs 的生化分析中量化游离和酯化胆固醇的量。在质膜中，酯化胆固醇的量约为游离胆固醇的四分之一。在剪切应力刺激下，顶端质膜中的酯化胆固醇和游离胆固醇显著降低。

实验结论：

本研究表明，D4 成像能够描绘活细胞质膜中的胆固醇。EGFP-D4YDA和mCherry-D4YDA信号均定位于质膜，但由于显微镜分辨率有限，无法在同一细胞内直观分离分布于质膜内外两层的胆固醇。

D4 成像和流式细胞术显示剪切应力显着降低了 HPAECs 中的质膜胆固醇，这与胆固醇的生化测量结果一致。

质膜胆固醇的下降主要发生在顶尖质膜，且呈剪应力依赖性和可逆性。虽然剪应力降低质膜胆固醇水平的机制尚不清楚，但可能与水以脂质顺序依赖的方式进入质膜有关。

之前使用Laurdan荧光成像的研究显示，在剪切应力的作用下，随着质膜脂质顺序的降低，进入脂质双分子层的水量增加，从而为疏水性胆固醇离开质膜提供了合适的条件。

总之，研究表明，质膜胆固醇动力学在HPAEC对剪切应力的反应中起重要作用。

参考文献：Yamamoto K, Nogimori Y, Imamura H, Ando J. Shear stress activates mitochondrial oxidative phosphorylation by reducing plasma membrane cholesterol in vascular endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Dec 29;117(52):33660-33667. doi: 10.1073/pnas.2014029117. Epub 2020 Dec 14. PMID: 33318210; PMCID: PMC7776821.

原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33318210/

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