VAMP3 和SNAP23 介导扰流诱导的内皮细胞microRNA分泌和平滑肌细胞增殖

动脉分支和弯曲处的血管内皮细胞 (ECs) 会经历血流紊乱，并诱导相邻平滑肌细胞 (SMCs) 的静止到激活的表型转变和随后的细胞增殖。然而，EC 到 SMC 信号流模式特定启动的潜在机制仍然尚不清楚。

以此为起点，由北京大学基础医学院周菁研究员团队与美国加州大学圣迭戈分校钱煦教授团队联合发表的题为《VAMP3 and SNAP23 mediate the disturbed flow-induced endothelial microRNA secretion and smooth muscle hyperplasia》的研究论文，研究了VAMP3 和SNAP23在流量调节的miRNA分泌中的参与，以及它们在 EC 导向的 SMC 功能调节中的作用。

部分实验内容：

OS 上调 VAMP3 和 SNAP23 并诱导它们在 ECs 中的易位

与应用 pulsatile shear (PS)（12 ± 4 dynes/cm 2 , 1 Hz）相比，将oscillatory shear (OS)（0.5 ± 4 dynes/cm 2 , 1 Hz）应用到 ECs 6 小时显着增加了 VAMP3 （vesicle-associated membrane protein 3）和 SNAP23 （synaptosomal-associated protein 23 ）的表达。

在暴露于 PS 的 ECs 中观察到的最主要的表型是 VAMP3 的核周定位，具有浓缩外观；与此相反，OS导致VAMP3 的外观更加分散。SNAP23主要位于PS暴露后的ECs的质膜和分散的胞质结构中。相比之下，在OS暴露后，SNAP23集中于质膜。

在小鼠主动脉中，VAMP3 和SNAP23在局部血流紊乱的主动脉(AA)弓内弯处的内皮细胞表达高于局部血流以层状为主的胸降主动脉(TA)。

TA中 VAMP3 的亚细胞定位主要集中在核周并凝聚，这一结果与PS下培养ECs 的结果一致。相比之下，AA 中的 VAMP3 主要位于分散的点状细胞质结构中，与 OS 下培养的 ECs 的观察结果一致。

在 TA 中，绝大多数 SNAP23 出现扩散，其中一部分位于质膜。在 AA 中，SNAP23 染色更强，SNAP23 与 CD31（ECs 的细胞间连接蛋白）的共定位增加。

总的来说，这些结果表明 OS/扰流上调 VAMP3 和 SNAP23 的表达并诱导它们的“细胞内到表面”的易位。

VAMP3 和 SNAP23 介导 OS 诱导的 miR-126-3p 分泌

将ECs暴露于PS或OS 24小时后，收集血流灌注液，然后进行连续的超离心以沉淀细胞外泡，包括外泌体，然后在囊泡少的上清液上进行qRT-PCR阵列，用引物识别218个内皮丰富的miRNAs。

在阵列上的218个miRNAs中，有15个miRNAs被OS和PS差异调控(P < 0.05)，其中11个miRNAs的倍数变化大于2.0或小于0.5。这11个miRNA的预测靶基因属于多种生物过程，表明受流量调节的 miRNA 分泌的多样性，说明其分泌在调节血管功能中的潜在重要性。

常规的qRT-PCR验证了miR-126-3p、miR-200a-3p、miR-143-3p和miR-146a-5p的结果。我们在ECs中敲除 VAMP3 /SNAP23，将细胞置于OS或静态条件下，然后检测OS灌注液或条件培养基中的miRNA水平。

在四种经验证的 miRNA 中，VAMP3 和 SNAP23 的消耗减少了静态 EC 条件培养基和 OS 灌注液中 miR-126-3p 和 miR-200a-3p 的富集。有趣的是，VAMP3 和 SNAP23 的敲低并未降低条件培养基或 OS 灌注液中 miR-143-3p 和 miR-146a-5p 的水平，也不会导致miR-126-3p、miR-143-3p、miR-146a-5p或miR-200a-3p的初级或成熟形式，表明VAMP3和SNAP23不干扰细胞内miRNA 的表达或成熟。

VAMP3/SNAP23 在 miRNA 分泌中的调节作用通过它们的过表达进行了进一步研究。

过表达VAMP3/SNAP23本身促进了miR-126-3p的分泌，能够克服敲低VAMP3/SNAP23对miR-126-3p分泌的抑制作用。

VAMP3 和 SNAP23 是 miR-126-3p 介导的 EC 到 SMC 信号转导所必需的

实验检测了VAMP3和SNAP23在EC向SMC转移miR-126-3p中的作用，以及它们对 EC调节SMC表型和行为的贡献。在静态条件下，SMCs与ECs共培养比单培养增加SMC miR-126-3p；SMC的这种增加在转染VAMP3和SNAP23后被ECs消除，并在重新引入miR-126-3p模拟物后再次出现。

对与静态EC共培养的SMCs中收缩基因表达的分析表明，通过敲除EC中的VAMP3和SNAP23, EC共培养对calponin、smoothelin、SM22α和MYH11的抑制被消除；随着在 ECs 中用 miR-126-3p 模拟物处理后，抑制再次出现。

Transwell迁移实验表明，转染对照siRNA的ECs可诱导SMC迁移。这种效应被转染了VAMP3-和SNAP23-specific siRNAs 的ECs所消除，但通过共转染这些siRNAs 和miR-126-3p模拟物来维持这种效应。

增殖标记物Ki67 的免疫染色表明，使用对照ECs 或共转染VAMP3-和SNAP23-specific siRNAs 和miR-126-3p模拟物的ECs 条件培养液处理SMCs可诱导SMC增殖，而在没有miR-126-3p模拟物的情况下，仅转染siRNAs 的ECs则不会诱导SMC增殖。

实验结果：

该实验展示了剪切应力调节microRNA分泌的机制，包括对VAMP3和SNAP23的调控。VAMP3/SNAP23 的内皮抑制减少了 microRNA-126-3p 的分泌，并挽救了由促动脉粥样硬化的血流剪切力改变的 SMC 表型。

此次实验发现为非编码RNA介导的振荡剪切力对血管功能的有害影响提供了一个机制解释，提示靶向内皮囊泡转运系统在平滑肌增殖性疾病控制中的治疗潜力。

参考文章：Zhu JJ, Liu YF, Zhang YP, Zhao CR, Yao WJ, Li YS, Wang KC, Huang TS, Pang W, Wang XF, Wang X, Chien S, Zhou J. VAMP3 and SNAP23 mediate the disturbed flow-induced endothelial microRNA secretion and smooth muscle hyperplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Aug 1;114(31):8271-8276. doi: 10.1073/pnas.1700561114. Epub 2017 Jul 17. PMID: 28716920; PMCID: PMC5547597.

原文链接：http://sci-hub.ren//28716920/

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