血小板促进 CD133+ 骨髓干细胞向内皮细胞和啮齿动物肝脏的募集—P-选择素/PSGL-1 的相互作用

血小板促进 CD133+ 骨髓干细胞向内皮细胞和啮齿动物肝脏的募集—P-选择素/PSGL-1 的相互作用

德国杜塞尔多夫大学医院外科、柏林夏里特医院、约翰内斯古腾堡大学血栓和止血中心等研究团队之前已经证明,CD133+ 骨髓干细胞(BMSC)可以在临床前以及临床肝脏切除和再生的环境中支持肝修复,同时证明了在广泛肝切除术后 CD133+ BMSC的动员,后者似乎是肝细胞生长因子和基质衍生因子-1(SDF-1)介导的 。其他研究显示,造血 CD133+ 干细胞与血小板相互作用导致 SDF-1 表达增加的重要作用。最近发现CD133+ BMSC 与血小板共同培养时,以 CD39 依赖性方式控制其血栓形成反应。此外,血小板在介导肝损伤中具有主要作用。越来越多的证据表明,血小板在肝损伤和肝切除后肝再生的各种临床前和临床情景中发挥着重要的复杂协调作用。血小板与肝窦内皮细胞 (LSEC)的相互作用以及 ADP、血清素和其他血小板生长因子的释放似乎对调节肝再生的早期阶段具有至关重要的影响。



血小板释放颗粒内容物,直接刺激肝细胞增殖或血小板转移 RNA,通过 mRNA 的翻译或调节 RNA 的作用促进肝细胞增殖,血小板介导的肝再生潜在机制可能涉及促进炎症反应。据报道,血小板通过激活造血血管生态位产生促再生内皮旁分泌/血管分泌因子,在肝损伤后的修复中发挥作用。之前在啮齿动物模型中表明,CD39 动员 BMSC 促进部分肝切除术后肝再生和增殖。

在这项研究中,该团队提出血小板在介导 BMSC 与肝血管再生系统的相互作用,测试了血小板促进 CD133+ BMSC LSECs 募集的潜力。在流动条件下表征血小板/内皮细胞相互关系的潜在受体—配体相互作用。此外评估了血小板-CD133+ BMSC 相互作用对这些干细胞在热缺血后归巢到孤立的单次灌注大鼠肝脏(IPRL)的影响。




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体外剪切应力下血小板增强 CD133+ BMSC 对人微内皮细胞的粘附

由于已证明血小板对肝损伤和再生有显著影响,尤其是对 LSEC ,因此进一步研究了 CD133+ BMSC皮细胞相互作用在流动条件下血小板对局部血管归巢的作用。实验建立了活细胞成像系统(BIOFLUX),其中人微血管内皮细胞(HMEC-1)在流动条件下在 BIOFLUX 系统的毛细血管中培养,随后与富含人血小板的血浆(hPRP)和原代人 CD133+ BMSC 在不同条件下共培养,然后再输注到 BIOFLUX 系统。在 1.0 dyn/cm2 的剪切应力水平下,可以证明与 hPPP 相比,hPRP 共培养可显著增加粘附于人微内皮细胞的 CD133+ BMSC 的数量,平均增加 2.6 倍(图1 a)。


血小板促进 CD133+ 骨髓干细胞向内皮细胞和啮齿动物肝脏的募集—P-选择素/PSGL-1 的相互作用



图1 P-选择素/PSGL-1 依赖性血小板与 CD133+ BMSC 的相互作用促进在剪切应力下与人微 EC 的粘附。
分别在对照和一次处理两种不同条件下,CD133+ BMSC 对与人富含血小板的血浆(hPRP)共培养的人微内皮细胞(HMEC-1)的粘附性进行成对测试:
(a)与贫血小板血浆(hPPP)相比,CD133+ BMSC与 hPRP的粘附性增加。
(b、c)血小板与 P-选择素抑制剂 KF38789 和 CD133+ BMSC 与 PSGL-1 拮抗剂 IM2090 的预孵育均显示 CD133+ BMSC 的粘附性降低。
(d-f)与 PECAM-1 阻断抗体 mPECAM-1.3 IgG(anti-PECAM-1)、重组可溶性人 PECAM-1(rhsPECAM-1)和用于 SDF-1 相互作用的 CXCR4 抑制剂 AMD3100 共同孵育都分别缺乏对 CD133+ BMSC 粘附到 HMEC-1 的调节作用。


P-选择素/PSGL-1 轴在血小板促进 CD133+ BMSC 对人微内皮细胞粘附作用中的相关性

为了研究特异性受体—配体相互作用在血小板对人CD133+ BMSC在流动条件下沿人EC粘附能力的影响,实验首先在检测了P-选择素及其配体PSGL-1在这方面的作用。与 CD133+ BMSC 的非拮抗性 hPRP 共培养相比,hPRP P-选择素特异性拮抗剂 KF38789 的预培养降低了粘附水平,在血小板贫乏条件下也观察到相似水平(48.3 +/- 24.4% vs 39.3 +/- 26.1%,图1b)。同样,CD133+ BMSC 上的 PSGL-1 阻断显示对血小板的降低作用,这取决于 CD133+ BMSC 在剪切应力下对 EC 的粘附增加(图1 c)。

接下来评估了 PECAM-1 EC 结合血小板的影响。通过 PECAM-1 阻断抗体预处理 EC(图1 d)或共注入重组可溶性 PECAM-1(图1 e)来抑制 PECAM ,对血小板促进 CD133+ BMSC EC 的粘附没有调节作用。之前已经证明 SDF-1/CXCR4 相互作用与 CD133+ BMSC 在实质损失后的临床肝再生过程中的全身动员相关,于是测试了 CXCR4 抑制剂(AMD3100)对血小板促进 CD133+ BMSC HMEC1 的粘附的调节作用。然而,在与 AMD3100 共培养后,CD133+ BMSC HMEC-1的粘附率没有变化(图1 f)。

这些结果表明,BMSC 上的 PSGL-1 与其血小板上的受体 P-选择素相互作用可能对增强血小板介导的 CD133+ BMSC 沿 EC 归巢很重要。相比之下,PECAM-1 SDF-1/CXCR4 轴似乎在这种情况下只起很小的作用。




体外血小板促进 CD133+ BMSC 对内皮的粘附作用在啮齿类动物微内皮细胞和 LSEC 中保持不变,不受进一步刺激

接下来测试了血小板在人类剪切应力共培养模型中的同种异体啮齿动物中的影响。与血小板不良条件相比,小鼠血小板(mPRP)对小鼠(mCD133+ BMSC 具有与对小鼠真皮微内皮细胞(dMEC)相似的粘附增强作用(mPRP vs mPPP 1.44 倍(+/- 0.17),图2 a)。此外,用强血小板激活剂 ADP 刺激血小板对 CD133+ BMSC 粘附表现出更显著的影响(图2 b)。然而,当直接与非活化血小板共培养相比时,只注意到一个不显著的趋势(+ADP vs -ADP)。为了证明肝窦内皮细胞在相同环境下的血小板效应,在流动室系统中使用小鼠肝窦内皮细胞(mLSEC),并观察到 mCD133+ BMSC 粘附于 mLSEC 的类似阳性血小板效应(1.31 倍,图2 c)。


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图2 在小鼠剪切应力模型中,血小板共培养后 CD133+ BMSC 对内皮细胞的粘附性增强。实验在 1.0 dyne/cm2 的剪切水平下进行,随后以 mPPP 对照条件的百分比对粘附的 CD133+ BMSC 进行量化。
(a)与 mPPP(小鼠血小板贫乏血浆)相比,使用 mPRP 的小鼠 CD133+ BMSC 与小鼠真皮微内皮细胞(dMEC)的粘附显著增加。
(b)ADP 激活血小板并没有进一步增强 mPRP 效应。
(c)增强血小板对 mCD133+ BMSC 粘附对 mLSEC 的作用。



血小板在热缺血后的再灌注过程中促进 CD133+ BMSC 的肝脏归巢和外溢

接下来在单次异种 IPRL 系统中测试了热缺血后,血小板对 CD133+ BMSC 向啮齿动物肝脏微结构的肝归巢能力的影响(图3)。通过原位视频显微镜跟踪CD133+ BMSC,以检测肝窦内与 LSEC 的粘附以及作为外渗标志的 BMSC 与肝实质细胞的共定位(图4 a)。

为了证明和量化血小板在肝热缺血和再灌注后对 BMSC 归巢的影响,在三个实验组中对 IPRL 进行CD133+ BMSC 注射:I 组:仅 CD133+ BMSC-PRP);II 组:在大鼠肝脏与血小板预输注后 CD133+ BMSCPRP 后);第 III 组:CD133+ BMSC 在与血小板共同培养后(与 PRP)。在肝热缺血后,与 I 组相比, II 组和 III 组中归巢的CD133+ BMSC的数量增加趋势不明显(图4 b)。与 I 组相比,II 组和 III CD133+ BMSC 外溢水平显著增加(图4 c)。如果与干细胞输注前的血小板相比,与 CD133+ BMSC共培养的阳性趋势在统计学上不显著。随后,与组 I (4.2 + / − 2.6;图 4d)。随后,每10个高能场中,II组(9.9 +/−2.6细胞)和III组(13.3 +/−5.7细胞)的CD133+ BMSC的绝对数量显著高于I组(4.2 +/−2.6,图4 d)。


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图3 具有视频辅助原位成像的离体异种 IPRL 模型。
箭头方向表示原位系统中的缓冲液和细胞流动。分析肝脏内的黑色阴影条纹代表 70% 的肝切除术。将大鼠肝脏的门静脉插管并留在原位,并通过上腔静脉的插管引流肝脏。

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图4 在缺血和再灌注损伤模型中,血小板增加 CD133+ BMSC 结合和外渗。



肝热缺血再灌注损伤过程中人CD133+ BMSC 归巢的定位

在热缺血和随后通过门静脉输注人 CD133+ BMSC 后,应用免疫荧光染色和共聚焦显微镜来表征 CD133+ BMSC 向大鼠肝脏的归巢。在连续再灌注 2.5 小时后取自大鼠肝脏的连续肝组织切片,对不同的细胞特异性标记蛋白以及人 CD45 进行染色,这都对输注的 CD133+ BMSC 具有特异性。灌注 2.5 小时后,在肝组织内发现了具有正常核质比的 CD133+ BMSC(图5 a)。

CD133+ BMSC 不仅位于结缔组织区域,而且特别发现与肝细胞密切接触,这可以从它们与 F-肌动蛋白和 Ntcp 阳性肝细胞的接近来证明(图5 b-d)。通过共染色大鼠内皮细胞标记物 RECA-1 检测到,BMSCs 在外溢后进入实质细胞,与肝内皮和肝窦结构有一定距离(图5 e、f)。然而,由于热缺血性肝损伤,不能排除在一定程度上造成肝窦内皮层的破坏。由 3 区谷氨酰胺合成酶共染色表明,CD133+ BMSC 在肝区1 和 2 的腺泡和解剖小叶水平上检测到,而在中央小静脉周围区 3 中很少检测到细胞(图5 g、h),表明细胞沿着大部分肝窦道离开血液。


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图5 通过共聚焦荧光显微镜表征 IPRL中 CD133+ BMSC 的肝归巢。用抗 CD45 抗体(绿色)染色的CD133+ BMSC灌注大鼠肝脏。



血小板促进 CD133+ 骨髓干细胞向内皮细胞和啮齿动物肝脏的募集—P-选择素/PSGL-1 的相互作用



图6 图形概要
血小板模型可增加 CD133+ BMSC 对受损肝脏的肝归巢。响应肝脏中的剪切应力,血小板促进 CD133+ BMSC 的窦状黏附,随后转移到窦外间隙,均通过 p -选择素/PSGL-1相互作用进行。



在该研究中,表明流动条件下血小板依赖于 P-选择素/PSGL-1 相互作用促进 CD133+ BMSC 与人内皮细胞的相互作用。在啮齿动物模型中,在体外证实了血小板在剪切应力下对微内皮细胞以及对 LSEC 的粘附促进作用。此外,在嵌合人对大鼠模型中,肝热缺血后血小板与 CD133+ BMSC的共同给药增加了局部血管归巢和干细胞的外溢。该研究可能会带来新的方法来加速 BMSC 治疗策略在各种肝病的再生、保护和治疗中的功效。血小板可能是这方面的有用策略,以最大限度地提高治疗性应用 BMSC 的有效性。

参考文献:Lehwald N, Duhme C, Pinchuk I, Kirchner J, Wieferich K, Schmelzle M, Jurk K, Windmöller BA, Hübner W, Homey B, Bode J, Kubitz R, Benhidjeb T, Krüger M, Robson SC, Knoefel WT, Kehrel BE, Schulte Am Esch J. Platelets Boost Recruitment of CD133+ Bone Marrow Stem Cells to Endothelium and the Rodent Liver-The Role of P-Selectin/PSGL-1 Interactions. Int J Mol Sci. 2020 Sep 3;21(17):6431. doi: 10.3390/ijms21176431. PMID: 32899390; PMCID: PMC7504029.



原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32899390/

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