在筛选的共培养条件下双向预诱导提高 hUCMSCs 成骨能力的新方法

在筛选的共培养条件下双向预诱导提高 hUCMSCs 成骨能力的新方法

为了实现骨缺损的非侵入性和更安全的定制化康复,间充质干细胞(MSCs)被建议用于基于3D打印(3DP)制成的骨支架定制的生物活性组织工程骨移植物,从而为临床环境提供有希望的证据。然而,人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的获取数量不能满足具有侵袭性过程的骨修复的巨大需求,并且细胞活性受供体年龄和健康状况的影响很大,极大地限制了临床应用。相比之下,人脐带间充质干细胞(hUCMSCs),存在于脐带华通氏胶(Wharton’s jelly)和血管周围组织中的一种间充质干细胞,具有更高的细胞产量、快速的增殖能力、大量分泌与细胞迁移、炎症、免疫调节、血管生成相关的细胞因子。最重要的是,hUCMSCs 不表达负责同种免疫反应的主要组织相容性复合物II(MHC II)和免疫调节因子 B7 共刺激分子。因此,认为 hUCMSCs 在组织工程骨制备过程中同时具有种子细胞和细胞因子的特性,将是增强组织工程骨移植物生物活性的一种有希望的选择。大量研究还表明,hUCMSCs 具有优异的成骨特性,是适合骨组织工程的种子细胞。鉴于一些研究认为 hUCMSCs 的成骨能力弱于 hBMSCs,因此提高 hUCMSCs 的成骨能力是值得的。



目前有研究已经提出了骨原细胞(干细胞、成骨细胞等)和血管生成细胞(内皮祖细胞、内皮细胞等)的共培养系统,已被证实具有促进成骨和血管生成的协同作用,有利于支架中成骨细胞的存活和预后,从而确保组织工程骨的成功骨化。然而,内皮祖细胞和内皮细胞的体外培养困难,分离的细胞数量非常少,增殖能力有限。此外,在共培养这两种细胞的临床应用中,不同的细胞来源会增加免疫排斥和疾病传播的风险。因此,为降低上述风险,应使用一种来源丰富的单一 MSCs 分别分化为成骨细胞和内皮细胞,然后再进行共培养。迄今为止,关于单一类型干细胞的双向分化的研究很少。

研究表明,两种细胞的混合比例以及用于共培养的培养基直接影响成骨的结果。大多数研究人员更喜欢采用两种细胞按1:1混合的方法,在成骨诱导培养基或共培养培养基(50% 成骨诱导培养基和 50% 内皮生长培养基)中培养。迄今为止,还没有关于 hUCMSCs 双向分化的培养条件的详细报道。

广州医科大学附属口腔医院、云南省第一人民医院口腔科、荷兰阿姆斯特丹牙科学术中心等联合团队的一项研究将 hUCMSCs 预诱导分化为成骨细胞和内皮细胞,然后在筛选的培养基中以不同比例共培养。通过比较不同比例的诱导细胞在 3D 打印磷酸三钙(TCP)支架上制备的组织工程骨移植物与颅骨临界骨缺损的修复效果,探讨并分析了预诱导 hUCMSCs 双向分化的共培养细胞的成骨效果,为 hUCMSCs 在骨组织工程中的应用提供了一种先进的方法。


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hUCMSCs 的成骨分化

为了评估 hUCMSCs 的成骨分化能力,进行了 ALP 活性定量和定性分析、成骨相关基因的表达和矿化结节的研究。成骨诱导4710天后,成骨培养基(OM)hUCMSCs ALP 染色呈紫色,比增殖培养基(PM)中的颜色更深,第 4 天观察到的颜色最深(图1 A),这与 ALP 活性定量检测一致(图1 B),表明观察期内 OM ALP 活性明显高于 PM,并在第 4 天达到最高水平,分别是第 7 天和第 10 天的两倍和三倍。同时,成骨诱导后各检测时间点 ALP OPN mRNA 表达均显著升高,并随时间逐渐升高,而 RUNX2 COL1 基因的表达仅在第 4 天显著升高(图1 C )。ARS 诱导后第 3 周出现散在性钙结节,5 周后出现斑块。PM 组未发现钙结节(图1 D)。


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图1 hUCMSCs 的成骨分化。
(A)非诱导和成骨诱导的 hUCMSCs 的 ALP 染色 4、7 和 10 天和(B)ALP 定量分析。
(C)成骨相关基因 ALP、RUNX2、COL1、OPN 在诱导 4、7、10 d后的表达。
(D)非诱导和成骨诱导的 hUCMSCs 的 ARS 持续3 周和 5 周。第 5 周在 OM 中观察到更多的红色沉积物。



hUCMSCs 的内皮分化

内皮细胞诱导培养基(EIM)诱导三天后,hUCMSCs 变得细长,呈多边形,具有大量血管样结构(图2 A)。由于基质胶上的管形成和 ac-LDL 吞噬作用是确定诱导的 MSCs 是否具有内皮细胞功能的两个代表性实验,因此通过这两个测试检查了形态和功能的变化。研究表明,4 天的预诱导 hUCMSCs 在基质胶上接种 2.5 小时后,可以形成类似血管的网状结构,而正常的 hUCMSCs 呈簇状分布(图2 B)。同样,预诱导的 hUCMSCs 可以吞噬 Dil-ac-LDL,在蓝色细胞核周围发现红色荧光标记的 ac-LDL,而非诱导的 MSCs 不具有相同的功能(图2 C)。免疫荧光染色显示细胞诱导后呈圆形连接,在细胞质中表达动脉内皮细胞标记物 EphrinB2 和静脉内皮细胞标记物 EphB4(图2 D)。QRT-PCR 检测发现,诱导后第 4、7、10 天血管生成基因 EFNB2、EPHB4、VEGF、bFGF 表达增强,第 4 天 EFNB2、VEGF、bFGF 表达增强。所有测试的基因表达在第 7 天和第 10 天显著下降(图2 E)。相比之下,除了抗血管生成基因 SPROUTY1 的表达显著下降外,SERPINF1 和 ANGPTL1 的表达在整个期间增加,与 EFNB2、VEGF 和 bFGF 的表达相反(图2 F )。


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图2 hUCMSCs 的内皮分化。
诱导的 hUCMSCs 的形态显示为(A)在显微镜下用红色箭头指示的血管样结构,(B)基质胶中的血管生成和(C)Dil-ac-LDL 吞噬作用,细胞核呈蓝色和红色染色的 Dil 标记的 ac-LDL。
(D)免疫荧光法验证了 EphrinB2 和 EphB4 蛋白的表达。
(E)促血管生成相关基因 EFNB2、EPHB4、VEGF 和 bFGF,以及(F)抗血管生成相关基因 SERPINF1、ANGPTL1 和 SPROUTY1 在诱导 4、7 和 10 天后的表达。



共培养培养基的筛选

当预诱导的 os-hUCMSCs 和 en-hUCMSCs 共培养 17 天时,ARS 显示在 PM 中以 3:1、2:2 和 1:3 的比例共培养的细胞也具有成骨分化能力,并可形成钙结节(图3 A),与阳性对照组无统计学差异(图4 B)。同样,PM、OM、EMM(合成基础培养基,OM/EIM)(2:2)组与对照组之间无显著差异。仅在 PMM(比例混合培养基,OM/EIM)(3:1)培养基中,3:1 组形成大量散在性钙结节(图3 A),与其他组相比明显增加,光密度(OD)值比对照组高 5 倍左右(图3 B)。因此,选择 PMM(3:1)作为后续的共培养基。


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图3 筛选用于双向诱导 hUCMSCs 的共培养基。



共培养对 hUCMSCs 成骨和血管生成的影响

共培养后,3:1 组的细胞增殖率和 ALP 活性与 OM 中的 4:0 相似,为阳性对照(图4 A、B),而 3:1 组成骨相关基因 RUNX2、ALP 的蛋白表达高于 4:0 组(图4 C、D)。2:2 和 1:3 组的增殖率在整体观察中维持在较高的标准(图4 A)。从成骨相关基因和蛋白表达来看,2:2 组的 ALP、RUNX2 及其蛋白表达最高(图4 C、D)。相比之下,1:3 组在第 1 天和第 2 天的 ALP 活性与其他组相比最高(图4 B), 共培养 3 天后 ALP 基因表达下降, RUNX2 基因及其蛋白表达仍高于 4:0 组(图4 C、D)。

血管生成分析,与 0:4 组相比,3:1 组 ANG mRNA 表达量在第 3 天最高,2:2 组 PDGFB mRNA 表达量最高,1:3 组 VEGF mRNA 表达量最高(图4 C )。周细胞标志物 CD146 与血管稳定性有关,其基因和蛋白表达从 3:1 组逐渐下降到 0:4 组(图4 C、E)。

为了进一步说明共培养系统的血管生成能力,采用了基质胶管形成试验。预诱导3天(0天)后,en-hUCMSCs 混合百分比越高,基质胶上形成的血管小管越多,呈更完整、更连续的圆形(图5)。但共培养 3 天后,0:4 组仍具有良好的血管生成能力,但其他组的管状结构明显减弱,只有少量的分支结构(图5)。


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图4 双向预诱导 hUCMSCs 的共培养。
(A)细胞增殖曲线。(B)ALP定量研究。
(C)共培养3 d后成骨和血管生成相关基因的表达。
(D)共培养 3 天后 RUNX2 蛋白的表达和(E)CD146 蛋白的表达。


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图5 3 天共培养系统的管形成能力。



骨缺损的修复

手术后,所有大鼠均恢复良好。显微CT显示,术后4周,空白组缺损周边区域的宿主骨仅长出少量新骨。通过支架植入,支架上形成的骨骼更少。当加入 os-hUCMSCs 时,许多新骨沿支架均匀生长。此外,os-hUCMSCs 与 en-hUCMSCs 的 3:1 比例可以显著提高骨量、骨小梁数量和厚度(图6 A、B)。

为了进一步确保骨形成结果,HE 和 Masson 三色染色均被应用。从缺损区域新再生组织的大体上看,沿着宿主骨再生的少量粉红色结缔组织填充有轻微的新骨。通过支架植入,观察到中央部分有类骨质,有少量毛细血管。通过 os-hUCMSCs 涂层支架植入,红色染色的成熟骨在中心区域再生,沿着脱钙 TCP 支架的多孔结构形成致密、规则的结缔组织。在 3:1 组中,大量成熟骨散布在深粉色的骨腔,周围结缔组织较少(图6 A)。经 Masson 三色染色,3:1 组可见深红色染色的成熟骨和浅蓝色染色的胶原蛋白,而 4:0 组形成的成熟骨较少。组织学的定量研究也验证了 3:1 组具有更大的骨诱导能力(图6 C)。


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图6 大鼠颅骨缺损的体内康复结果。
(A)显微 CT 和组织学结果验证了不同方法的重建结果。
(B)定量比较新骨量、骨小梁数量和厚度。
(C)组织学研究发现的新骨百分比。




该研究证实,hUCMSCs 具有稍弱的成骨分化能力,可以在短时间内诱导分化成具有内皮功能的内皮样细胞。双向分化的 hUCMSCs 在 PM 中共培养成骨细胞和内皮细胞,成骨能力显著增强。此外,在相同比例的混合培养基中培养时,3:1 组在体外和体内均显示出最佳的成骨能力。这种双向预诱导 hUCMSCs 的共培养策略为构建具有生物活性的组织工程骨移植提供了一种新的方法,可用于临床移植增强成骨能力。

参考文献:Rong Q, Li S, Zhou Y, Geng Y, Liu S, Wu W, Forouzanfar T, Wu G, Zhang Z, Zhou M. A novel method to improve the osteogenesis capacity of hUCMSCs with dual-directional pre-induction under screened co-culture conditions. Cell Prolif. 2020 Feb;53(2):e12740. doi: 10.1111/cpr.12740. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31820506; PMCID: PMC7078770.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31820506/

图片来源:所有图片均来源于参考文献

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