葛根素通过 PI3K/Akt 通路缓解人髓核间充质干细胞中压缩诱导的细胞凋亡和线粒体功能障碍

椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration，IDD）是世界范围内最常见的病理性疾病之一。导致 IDD 的应激源很多，包括遗传易感性、胶原降解、生物力学超载和髓核细胞（NPC）增殖受损。髓核间充质干细胞（NPMSCs），也称为髓核（NP）祖细胞，具有与间充质干细胞（MSCs）相似的三向分化潜能，并且还发现在 IDD 期间会丧失细胞活力、数量和特性。至于其多向分化能力和组织特异性，NPMSCs 在 NPC 特异性分化方面可能优于非椎间盘（IVD-）衍生的 MSCs，并且可能是 IDD 的潜在治疗靶点。了解不利的微环境因素对 NPMSCs 的影响，例如压缩，可以为受损的 NP 组织的恢复铺平道路，这是治疗 IDD 的一种有前景的方法。

葛根素（PUR）是一种从葛根植物中提取的黄豆苷元的 8-C-葡萄糖苷，已被发现可有效治疗多种疾病，如心力衰竭、高血压、各种癌症、帕金森病、阿尔茨海默病以及糖尿病并发症。更具体地说，PUR 与自噬的修饰、活性氧（ROS）产生的减少和抗炎作用密切相关。然而，PUR对细胞凋亡的影响在各种细胞中是不同的。例如，PUR 可以抑制细胞凋亡并减少缺血引起的心肌损伤，同时促进癌细胞的凋亡。因此，PUR 在 IDD 发展过程中对 NPMSCs 命运的具体影响需要进一步阐明。

PUR 的药理活性涉及若干信号通路。PUR 可通过 PI3K/Akt1/GSK-3 β信号通路减轻海马神经元损伤。之前的研究发现，在不利的炎症微环境中，淫羊藿苷对人 NPCs的保护作用中 PI3K/Akt 信号通路被显著激活。由于 PUR 也可以通过 PI3K/Akt 信号通路保护神经细胞，因此假设这种机制可能适用于 PUR 对 NPMSCs 的影响。

在浙江大学医学院附属第二医院骨科、华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的一项联合研究中，通过在 NPMSCs 上应用压缩装置来研究细胞的活力和病理生理学，从而模拟导致 IDD 发展的微环境，旨在发现 PUR 对受损 NPMSCs 的影响以及 PI3K/Akt 信号通路的参与。文章名为《Puerarin Relieved Compression-Induced Apoptosis and Mitochondrial Dysfunction in Human Nucleus Pulposus Mesenchymal Stem Cells via the PI3K/Akt Pathway》。

压缩降低人 NPMSCs 的细胞活力并诱导细胞凋亡

为探索压缩促进细胞凋亡的作用，将 NPMSCs 在 1.0 MPa 压力下培养 0 h、12 h、24 h、36 h 和 48 h（图1）。随着加压时间（1.0 MPa）的延长，NPMSCs的细胞活力逐渐降低，说明加压对细胞增殖的损害呈时间依赖性，在12 h、24 h、36 h和48 h组表现明显（图1 a、b）。Caspase-3 活性以及 Annexin+/PI+ 和 Annexin+/PI- 细胞的百分比随着压缩力的延长而增加，这表明凋亡率上升（图1 c-e）。

图1 压缩降低了人 NPMSCs 的细胞活力并诱导了细胞凋亡。

（a）Edu染色增殖测定的结果显示NPMSC增殖因压缩而逐渐受损。

（b）CCK-8 测定的结果表明 NPMSC 细胞活力以压缩时间依赖性方式降低。

（c）定量分析表明，随着压缩时间延长，caspase-3 活性增加。

（d）进行 Annexin-V/PI 染色，通过流式细胞术测定人 NPMSCs 的凋亡率。Annexin-/PI-代表活细胞，Annexin+/PI-代表早期凋亡细胞，Annexin+/PI+代表晚期凋亡细胞，Annexin-/PI+代表坏死细胞。

（e）直方图分析显示凋亡的人 NPMSCs（Annexin+/PI- 加 Annexin+/PI+）的百分比。

NPMSCs 中的 PI3K/Akt 通路在压缩力和 PUR 的作用下改变

当 NPMSCs 在 1.0 MPa 的压力下持续 48 h时，观察到 PI3K/Akt 信号通路失活，p-PI3K（磷酸-Tyr524）和 p-Akt（磷酸-S473）降低。然而，p-Akt、PI3K 和 p-PI3K 的含量随着 PUR 的应用而增加，而 LY294002，一种特定的 PI3K/Akt 通路抑制剂，可以减少 p-PI3K、PI3K 和 p-Akt 并阻断 PUR 的促进作用（图2 a）。

同样，压缩力处理 48 h后，免疫荧光检测到 PI3K 和 p-Akt 在细胞质和细胞核中均减少。有趣的是，细胞质中 PI3K 和 p-Akt 的下调比细胞核中的下调更为显著。PUR 可以有效地恢复压缩力诱导的细胞质中 PI3K 和 p-Akt 水平的降低，而 LY294002 给药则从根本上消除了这种效应（图2 b、c）。此外，如果 PUR 和 LY294002 未经压缩力而单独预处理，200  μM 的 PUR 和 25  μM 的 LY294002 对细胞死亡和细胞凋亡没有影响。

图2 压缩诱导的 PI3K/Akt 信号通路阻断。

（a）通过蛋白质印迹分析 PI3K、p-PI3K（phospho-Tyr524）、Akt 和 p-Akt（phospho-S473）的蛋白质水平。

（b）用荧光显微镜观察 PI3K 和 p-Akt 的免疫荧光染色。

（c）PI3K 和 p-Akt 免疫荧光的定量分析。

PI3K/Akt 通路参与了 PUR 相关的人 NPMSCs 压缩诱导的细胞凋亡的延迟

Annexin-V/PI 荧光染色显示，1.0 MPa 压缩 48 h 后，凋亡早期和晚期细胞显著增加。有趣的是，200  μM PUR 在凋亡早期和晚期均有效缓解了压缩诱导的 NPMSCs 凋亡，而 PUR 的保护作用被 LY294002 消除（图3 a）。此外，定量分析表明，PUR 可降低压缩诱导的 NPMSCs 的凋亡率，而 LY294002 可阻断这种作用（图3 b）。Bax 蛋白水平在 48 h 压缩力处理下升高，Bcl-2 水平降低，表明细胞凋亡的发生（图3 c）。活化的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）的蛋白质水平也显著升高（图3(c)）。随着 PUR 的应用，Bax 和 cleaved caspase-3 减少，Bcl-2 增加（图3 c）。一致地，Bax 和 Bcl-2 转录物显示出相似的变化（图3 d）。PUR 的作用被 LY294002 阻断。

TEM 表明细胞的超微结构在48 h压缩处理后发生了显著变化。核固缩明显，内质网有明显的泡状形成，线粒体肿胀。此外，与 0 h相比，在 48 h的压缩下，细胞膜的突起消失了（图4 a、b）。此外，PUR 可以恢复由压缩引起的受损细胞超微结构（图4 c）。然而，PUR 的保护作用可能会消失，因为在额外处理 LY294002 后，细胞凋亡超微结构形态显著（图4 d）。

图3 PUR 通过 PI3K/Akt 通路缓解人 NPMSCs 中压缩诱导的细胞凋亡。

（a） Annexin-V/PI 染色图像表明 PUR 通过 PI3K/Akt 信号通路对压缩诱导的细胞凋亡的保护作用。绿色荧光代表早期凋亡细胞，红色荧光代表晚期凋亡细胞。

（b）流式细胞仪测定 NPMSCs 的凋亡率，直方图显示凋亡的人 NPMSCs的百分比。

（c）蛋白质印迹和（d）实时 PCR 分析基因表达（Bcl-2、Bax 和 caspase-3）和蛋白质水平（Bcl-2、Bax、caspase-3 和cleaved caspase-3）。

图4 PUR 防止了由长时间压缩引起的超微结构损伤。

（a）TEM 检测对照组（无压缩）的典型细胞形态。正常细胞膜（绿色）、细胞核（蓝色）、内质网（黄色）和线粒体（红色）用箭头表示。

（b）细胞在 48 h压缩后表现出显著的凋亡形态变化。箭头表示核固缩（蓝色）、内质网囊泡（黄色）和线粒体肿胀（红色）。细胞膜的突起（绿色）消失。

（c）PUR 的预处理在 48 h压缩下显著恢复了细胞形态。箭头表示相对正常的细胞核（蓝色）、线粒体（红色）和内质网（黄色）。

（d）LY294002 阻断 PI3K/Akt 通路后，在 NPMSCs 中观察到凋亡形态变化和超微结构破坏。箭头表示核固缩（蓝色）、内质网囊泡（黄色）和线粒体肿胀（红色）。

PUR 减轻压缩力下人 NPMSCs 的细胞间 ROS 积累和线粒体功能障碍

与 0 h对照组相比，指示 ROS 产生的绿色荧光在 48 h压缩组中上升，并且随着 PUR 的应用而降低（图5 a、b）。流式细胞仪定量分析表明，PUR 可缓解细胞间产生的 ROS，而这种作用可能会受到 LY294002 的干扰（图5 c、d）。

此外，1.0 MPa 压力持续 48 h导致线粒体功能显著异常。JC-1 说明通过预处理 PUR 可以缓解受损的线粒体膜电位（MMP）（图6 a-c）。PUR 还促进了腺苷三磷酸（ATP）的产生，压缩力显著削弱了 ATP 的产生，而 PUR 的有利作用因应用 LY294002 而减弱（图6 d）。

图5 PUR 通过 PI3K/Akt 通路在受压的人 NPMSCs 中缓解细胞间 ROS 积累。

（a）负载 DCFDA 的人 NPMSCs 中 ROS 产生的代表性荧光成像。

（b）ROS 荧光染色的定量分析。

（c）ROS流式细胞仪的直方图分析，代表每组NPMSCs的平均荧光强度。

（d）流式细胞术检测细胞间 ROS 的产生。

图6 PUR 在人 NPMSCs 中通过激活 PI3K/Akt 通路缓解了压缩诱导的线粒体功能障碍。

（a）JC-1 荧光显示 MMP 损失的典型荧光显微照片。红色荧光表示线粒体聚集体 JC-1，绿色荧光表示单体 JC-1。

（b）使用 JC-1 检测试剂盒通过流式细胞术检测 MMP 损失。

（c）图6中的直方图分析，代表每组 NPMSCs 中 MMP 损失的水平。

（d）压缩下ATP产量显著降低，PUR在一定程度上促进了ATP产量。

压缩力在体内诱导 IDD，而 PUR 在很大程度上缓解 IDD

一般而言，H&E染色显示，随着受压的扩大，对照组结构逐渐紊乱，细胞外基质（ECM）数量和细胞数量减少。类似地，与假手术组相比，S-O 染色显示压缩 2 周和 4 周时对照组的蛋白聚糖显著减少。PUR 注射并未显著加重假手术组的 IDD。此外，H&7染色显示PUR可以显著恢复ECM减少的数量和干扰的分布，增加存活细胞的数量，从而减轻2 周和 4 周组压缩力的破坏作用（图7 a、b）。此外，2 周和 4 周对照组中p-Akt阳性细胞的百分比明显降低，而PUR的给药可以增加NP组织中细胞的p-Akt蛋白含量（图7 c）。

图7 压缩在体内诱导IDD，而PUR在很大程度上缓解了它。

（a）观察到来自不同组的大鼠椎间盘的H&E和 SO染色。观察来自不同组的 NP 中 p-Akt（phospho-S473）的免疫组织化学检测。

（b）大鼠椎间盘退变组织学分级评分。

（c）NP 中 p-Akt 阳性染色细胞的统计评估。

图8 示意图显示葛根素可通过 PI3K/Akt 通路减轻压缩力诱导的人 NPMSCs 的细胞凋亡、ROS 积累和线粒体功能障碍。

总之（图8），PUR 可以通过激活 PI3K/Akt 通路稳定 MMP 和减弱 ROS 积累，在体外以及在大鼠 IDD 模型中减轻压缩力诱导的人 NPMSCs 的细胞凋亡和细胞死亡，并维持细胞内稳态。因此，PUR 可能是椎间变性疾病的潜在治疗靶点。

参考文献：Huang D, Peng Y, Ma K, Qing X, Deng X, Li Z, Shao Z. Puerarin Relieved Compression-Induced Apoptosis and Mitochondrial Dysfunction in Human Nucleus Pulposus Mesenchymal Stem Cells via the PI3K/Akt Pathway. Stem Cells Int. 2020 Jan 11;2020:7126914. doi: 10.1155/2020/7126914. PMID: 32399049; PMCID: PMC7201526.

原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/32399049/

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