甲氨蝶呤在扰动流下通过抑制 YAP/TAZ 对动脉粥样硬化的保护作用

动脉粥样硬化目前是全世界死亡的主要原因。动脉粥样硬化病变在血流紊乱（DF）部位的动脉中发展，剪切应力在斑块位置和进展中起关键作用。研究表明，抑制 Hippo 通路效应因子Yes-相关蛋白（YAP）和具有 PDZ 结合基序（TAZ）的转录共激活因子可减轻 DF 诱导的动脉粥样硬化病变的发展。YAP/TAZ 响应血流动力学并将机械信号转换为化学信号。DF促进YAP/TAZ活化和去磷酸化，去磷酸化形式的YAP从细胞质转移到细胞核，上调富含半胱氨酸的血管生成诱导因子61（CYR61）和结缔组织生长因子（CTGF ）等靶基因，并刺激促炎基因表达，从而增加单核细胞的附着和浸润，促进动脉粥样硬化的发生。

几项研究表明，长期低剂量甲氨蝶呤（MTX）治疗类风湿性关节炎与降低心血管疾病和心血管死亡率有关。MTX 增加一磷酸腺苷（AMP）和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷酸（AICAR）的细胞内积累，从而激活 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）。AMPK 在促进 YAP Ser127 位点磷酸化中发挥作用，使 YAP 磷酸化以诱导其细胞质定位和蛋白酶体降解，因此，AMPK 的激活导致 YAP 磷酸化和失活。

基于此，在哈尔滨医科大学附属第二医院心内科、心外科以及附属心肌缺血教育部重点实验室的一项研究中，假设 AMPK 通路介导 YAP/TAZ 功能失活和 MTX 的动脉粥样硬化保护作用，实验评估了 MTX 对动脉粥样硬化保护作用的贡献以及对 DF 保护作用的背后信号机制。文章名为《Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow》。

HUVECs中YAP/TAZ激活和核定位的血流动力学调节

为了研究 YAP/TAZ 在不同剪切力下 HUVECs 中的作用，将培养的 HUVECs 暴露于单向剪切应力（USS）12 dyn/cm2、扰流（DF） 0 ± 4 dyn/cm2 或静态条件（STA）下 10 小时。通过蛋白质印迹测量了 p-YAP（Ser127）、总 YAP/TAZ 和粘附分子的蛋白质表达水平。结果表明，DF 导致 p-YAP（Ser127）显著降低（图1 a、b）和 ICAM1、VCAM1 和 TAZ 表达显著增加（图1 a）。IF 染色显示 DF 导致 YAP/TAZ 核定位，而在接受 USS 的 HUVECs 中观察到增加的 YAP/TAZ 细胞质保留。此外，还通过 IF 检测了 YAP 磷酸化水平，发现DF显著降低p-YAP（图1 c）。

DF促进了YAP/TAZ的转录活性并显著增加了YAP/TAZ靶基因CYR61和CTGF的表达（图2 b）。相反，USS 增强了 p-YAP（图1a、2c ）并降低了 YAP/TAZ 靶基因表达（图2 b）。此外，生物力学拉伸介导 HUVECs 募集单核细胞的能力。使用细胞粘附测定，发现在 DF 下附着在 HUVECs 上的 THP1 单核细胞数量增加（图1 d），这伴随着粘附分子的上调（图1 a）。

这些结果表明，DF 导致 YAP 去磷酸化和激活，而 USS 导致 YAP 磷酸化和失活。

图1 YAP/TAZ 在 HUVECs 中激活和核定位的血流动力学调节。

（a）对经受 USS（单向剪切应力）、扰动流（DF）或静态（STA）控制的 VCAM1、ICAM1 和 YAP/TAZ 进行蛋白质印迹分析。

（b）蛋白质印迹分析在指定时间进行 DF 的 HUVECs 中 p-YAP 和 YAP 。

（c）不同流动模式下 HUVECs 中 p-YAP 和 YAP 的免疫荧光染色。

图2 MTX 治疗增加了 p-YAP 的水平并减轻了 YAP 靶基因和炎症因子的表达。

（a） HUVECs 用 MTX（0-100 nM）处理，48 小时后通过蛋白质印迹分析定量 p-AMPK。

（b） qRT-PCR 分析 YAP/TAZ 靶基因和不同流量的炎症因子。

（c）在 USS 下用或不用 MTX（100 nM）处理HUVECs，并通过蛋白质印迹分析定量 p-YAP。

（d）在 STA 或 DF 下用或不用 MTX 处理 HUVECs，并通过蛋白质印迹分析定量 p-YAP 。

MTX 磷酸化 AMPK 并减轻 DF 诱导的 HUVECs 中促炎细胞因子的表达

用 MTX（0-100 nM）处理 HUVECs，48 小时后通过蛋白质印迹定量 p-AMPK 水平。结果表明，在静态条件下培养的 HUVECs 中的 p-AMPK 以剂量依赖性方式增加，最大水平为 100 nM时（图2 a）。该浓度与患者血浆的常规治疗低剂量剂量一致。

为了确定 MTX 是否在血流动力学作用下改变促炎细胞因子的表达，使用 qRT-PCR 分析促炎细胞因子基因和 YAP/TAZ 靶基因的水平。在 DF 下观察到更高水平的IL-6、IL-8、CYR61和CTGF，而不是在 HUVECs 中的 USS，并且 MTX 处理显著抑制了它们的表达（图2 b）。

为了确定低剂量 MTX 是否诱导 AMPK 下游的变化，检测了不同流动条件下 p-YAP（Ser127）的蛋白质表达水平。结果表明，DF而非USS导致YAP磷酸化显著降低（图2 c、d）。然而，当在 USS 下比较 MTX 处理与对照效果时，没有观察到 YAP 磷酸化的显著变化（图2 c）。MTX处理导致DF或STA下p-YAP表达显著增加，后者导致MTX处理后p-YAP表达更高（图2 d）。

MTX 抑制 DF 诱导的 YAP/TAZ 活化并发挥动脉粥样硬化保护作用，而沉默 AMPKα 可逆转这些作用

接下来探讨了 MTX 是否在生物力学拉伸下介导 HUVECs 中的 YAP/TAZ 失活。蛋白质印迹分析显示，DF 下 MTX 显著上调 p-YAP 和 p-AMPK 的表达，并显著降低 ICAM1 和 VCAM1 的水平（图3 a）。还观察到总 YAP 在细胞质中以高水平组成性表达，并且在 DF 下 MTX（100 nM）处理后单核细胞粘附减少（图3 b、c）。这些数据表明 MTX 介导 YAP 抑制并减少单核细胞-HUVEC 相互作用，至少部分有助于抗动脉粥样硬化作用。

因为 YAP 可以被 AMPK 磷酸化，于是进一步探讨了 AMPK 在这种 MTX 诱导的保护作用中的作用，并确定 MTX 介导的 YAP 磷酸化是否依赖于 AMPK。siRNA 耗尽 AMPKα（图3 d）促进了 YAP 核转位，几乎消除了 MTX 介导的 YAP 磷酸化（图3 a）和 p-YAP 细胞质定位（图3 b），表明 AMPK 在介导 MTX 诱导的YAP 失活中的关键作用。在 HUVECs 中敲低 AMPK 后，DF 下单核细胞粘附蛋白的水平和单核细胞粘附均显著增加（图3 a、c）。

图3 MTX 抑制 YAP 激活，而沉默 AMPKα 会消除这种效应。

（a）每次处理后 HUVECs 中 p-YAP、YAP、p-AMPK、总 AMPK、β-肌动蛋白、ICAM-1 和 VCAM-1 的代表性蛋白质印迹。

（b）HUVECs中p-YAP和YAP的免疫荧光染色。

（c） THP1 细胞（蓝色）在 DF 下与不同处理的 HUVECs 粘附的代表性图像。

沉默 YAP 会降低 DF 下的粘附分子表达

为了进一步证实 YAP 和 DF 诱导的促炎反应之间的关联，针对 YAP 的 siRNA 被用来检查 YAP、粘附分子和 AMPK 之间的相互作用。蛋白质印迹结果表明，敲除 YAP 显著抑制 ICAM1 和 VCAM1 的表达，但不改变 DF 下的 p-AMPK 蛋白水平（图4 a、b），表明 AMPK 作用于 YAP 上游，并且 YAP 耗竭可能导致动脉粥样硬化。

图4 沉默 YAP 会降低粘附分子的表达，但不会改变 DF 下的 p-AMPK 表达。

（a）用 siYAP 或 siNC 转染 HUVECs，进行 DF 24 小时，检测 YAP、VCAM1、ICAM1、p-AMPK 和 AMPK。

（b） YAP，在用 siNC 或 siAMPKα 转染 36 小时后的 HUVECs 中通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹测量。

MTX对DF诱导的细胞凋亡和YAP磷酸化的影响

受损的内皮功能包括动脉粥样硬化的早期阶段。实验采用流式细胞仪检测 DF 下的细胞凋亡。与 STA 相比，DF 而不是 USS 的应用显著增加了总细胞凋亡率。然而，用 MTX 治疗并没有减少细胞凋亡（图5 a、b）。

使用蛋白质印迹分析，检测到在 DF 下用 MTX 和广泛使用的动脉粥样硬化药物阿托伐他汀处理的 HUVECs 中 p-YAP 表达水平相当。结果表明，在 MTX（100 nM）或阿托伐他汀（1 μM）存在下细胞暴露于 DF 会导致 YAP 过度磷酸化。MTX和他汀类药物治疗之间的p-YAP表达水平没有统计学上的显著差异（图5 c）。

图5 MTX 对 DF 诱导的 HUVECs 细胞凋亡没有影响，而阿托伐他汀促进 YAP 磷酸化。

（a）HUVECs 与 MTX 一起孵育 48 小时，然后再进行 10 小时的生物力学拉伸。

（b）流式细胞术定量，与STA下相比，DF 增加了总细胞凋亡率。然而，用 MTX 治疗并没有减少细胞凋亡。

（c）显示了 p-YAP 蛋白质水平的蛋白质印迹结果（左）和定量数据（右）。

MTX 治疗可减少体内 DF 诱导的斑块形成

为了确定低剂量 MTX 在体内的潜在抗动脉硬化作用，在左颈总动脉周围放置了一个铸型以诱导 DF。在暴露于西式饮食 4 周后，在 DF 区域出现了明显的动脉粥样硬化病变（图6 a）。YAP/TAZ 染色在动脉粥样硬化切片的内膜、中层和内膜增生斑块中显著（图6 b）。相反，用MTX治疗小鼠导致动脉粥样硬化斑块（图6 a、b）和YAP/TAZ的相对表达（图6 c）显著减少。此外，DF 区域的管腔大于 0.9% 盐水处理的管腔（图6 a）。

图6 经 MTX 处理的动物在 DF 区域具有较低的斑块负荷和YAP/TAZ 表达水平。

（a、b）来自铸型上游区域的代表性 H&E 和 Masson 染色的正常左颈动脉切片。

（c）用 0.9% 盐水或 MTX 处理的正常左颈动脉的代表性免疫荧光图像。

图7 甲氨蝶呤（MTX）通过激活 AMPK-YAP/TAZ 信号通路保护介导的 HUVECs 免受干扰流（DF）损伤的可能机制示意图。

总之，得出结论，MTX 通过 AMP 依赖性激酶（AMPK）-YAP/TAZ 通路发挥保护作用。从治疗的角度来看，这些发现提供了对 MTX 赋予动脉粥样硬化保护机制的见解，并可能有助于开发新的治疗方法来限制动脉粥样硬化。

参考文献：Liu D, Lv H, Liu Q, Sun Y, Hou S, Zhang L, Yang M, Han B, Wang G, Wang X, Du W, Nie H, Zhang R, Huang X, Hou J, Yu B. Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow. J Transl Med. 2019 Nov 15;17(1):378. doi: 10.1186/s12967-019-02135-8. PMID: 31730006; PMCID: PMC6857284.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31730006/

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。

微信搜索公众号“Naturethink”，学习更多关于流体应力刺激细胞培养相关知识吧！