晚期糖基化终末产物通过 RAGE/TLR4 信号介导的 M1 巨噬细胞极化依赖性血管平滑肌细胞表型转换诱导动脉粥样硬化

晚期糖基化终末产物通过 RAGE/TLR4 信号介导的 M1 巨噬细胞极化依赖性血管平滑肌细胞表型转换诱导动脉粥样硬化

血管平滑肌细胞(VSMCs)位于动脉血管中膜,维持动脉结构完整性和血管张力。已在 VSMCs 中鉴定出一系列表型。VSMCs 在生理条件下处于静止状态并呈现收缩表型。当受到有害刺激时,VSMCs 会失去收缩特性并转化为合成表型,这对动脉粥样硬化斑块的形成和进展至关重要。研究表明,delta-样配体4-(Dll4-)激活的 Notch 信号通路在 VSMC 收缩合成表型转换中是必不可少的。据报道,DLL4 阻断有效减轻包括动脉粥样硬化在内的几种代谢紊乱。

动脉粥样硬化(AS)斑块的形成、进展和演变与巨噬细胞高度相关,巨噬细胞响应不同的刺激而有不同的极化。一般来说,巨噬细胞主要可分为 M1 型即经典活化的巨噬细胞,和 M2 型即替代性活化的巨噬细胞。由于它们的促炎特性,M1 巨噬细胞被认为有助于动脉粥样硬化病变的生长和斑块的不稳定性。根据最近的一项研究,静止的巨噬细胞(M0)到 M1 的极化可以由各种代谢物驱动,例如晚期糖基化终产物(AGEs)。

AGEs 2 型糖尿病(T2DM)的一组代表性代谢物,与 AS 高度相关。通过与 AGEs 受体(RAGE)相互作用,AGEs 引发各种病理结果。最近的研究表明,AGEs RAGE 之间的相互作用激活了 toll 样受体4TLR4)信号通路,从而促进了巨噬细胞 M0 M1 的极化。初步研究证实,AGE 诱导的 M1 极化巨噬细胞具有高表达 Dll4 的特点。因此,假设 AGEs M0 M1 极化期间赋予巨噬细胞高表达 Dll4。这些巨噬细胞将通过激活 Notch 信号进一步促进 VSMCs 进行从收缩到合成的表型转换。

在陕西省人民医院心血管内科的一项研究中,T2DM AS 动物被给予 TLR4 的特异性抑制剂 TAK-242,观察抗 AS 效应。M0 巨噬细胞暴露于外源性 AGEs,然后与原代 VSMCs 共培养。巨噬细胞 TLR4 信号通路被特异性小干扰 RNAsiRNAs)抑制。这项研究的结果将增加对糖尿病相关AS机制的更多了解,并为未来潜在的基因靶向治疗提供更多线索。


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抑制 TLR4 抑制以高血清 AGE 浓度为特征的 AS DM 动物动脉粥样硬化病变中动脉狭窄、M1 巨噬细胞浸润和 VSMC 表型转换
AS 对照相比,AS DM 小鼠的血清空腹血糖(FBG)和 AGE 浓度显著升高(图1 a)。在从 AS DM 动物取样的主动脉根部中发现了显著增加的动脉狭窄、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、RAGETLR4 表达和降低的肌球蛋白重链11MYH11)表达(图1 b-d)。TLR4 抑制剂 TAK-242 的给药未能影响 AS DM 小鼠的血清 FBG AGE 浓度(图1 a)。在 TAK-242 给药的 AS DM 小鼠的 AS 病变中发现动脉狭窄、iNOS TLR4 表达显著降低,但 MYH11 表达增加(图1 b-d)。

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图1
(a)表示空腹血糖(FGB)和血清 AGE 浓度。
(b)主动脉根部的 H&E 染色显示动脉粥样硬化斑块。
(c)捕获的 iNOS 的免疫荧光染色图像,还演示了 DAPI 及其合并图像。
(d)捕获的 MYH11 的免疫荧光染色图像,还演示了 DAPI 及其合并图像。
(e)捕获的 RAGE 免疫荧光染色图像。还演示了 DAPI 及其合并图像。
(f)捕获的 TLR4 的免疫荧光染色图像。还演示了 DAPI 及其合并图像。
AS:动脉粥样硬化小鼠;AS+DM:动脉粥样硬化糖尿病小鼠;AS+DM+TAK:用 TAK-242 处理的动脉粥样硬化糖尿病小鼠


靶向沉默的 RAGE/TLR4 通路抑制 AGE-BSA 诱导的巨噬细胞 M0 至 M1 极化
将原代 M0 巨噬细胞暴露于 0100 200  μg/mL AGE-牛血清白蛋白(BSA48 小时。如图2 a 所示,AGE-BSA 暴露增加了 iNOS 的表达,iNOS 被认为是巨噬细胞 M1 表型的标志物, 且呈 AGE-BSA 浓度依赖性方式。同时,如图2 bc所示,AGE-BSA 暴露以 AGE-BSA 浓度依赖性方式增加巨噬细胞中 RAGE TLR4 的表达水平。暴露还以 AGE-BSA 浓度依赖性方式增加促炎细胞因子的分泌,包括 IL1β IL6 TNFα(图2 d)。在暴露于 200  μg/mL AGE-BSA 的巨噬细胞中,靶向沉默 RAGE TLR4 被证明可以有效(图2 bc)降低 iNOS 表达(图2 a)和促炎细胞因子浓度(图2 d)。


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图2
(a)捕获的 iNOS 的免疫荧光染色图像,还演示了 DAPI 及其合并图像。
(b)表示巨噬细胞中RAGE和TLR4的相对mRNA表达水平。
(c)免疫印迹显示巨噬细胞中 RAGE、TLR4 和 GAPDH 。右图的列表示巨噬细胞中 RAGE 和 TLR4 的相对表达水平。
(d)表示巨噬细胞的细胞培养基上清液中IL1β、IL6 和 TNFα的浓度。


沉默 RAGE/TLR4 通路降低 AGE-BSA 孵育的巨噬细胞中 Dll4 的表达
在巨噬细胞中,AGE-BSA 暴露显著增加了细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平(图3 a)以及叉头框蛋白C2FOXC2 Dll4 表达水平(图3 b),且呈 AGE-BSA 浓度依赖性方式。在暴露于 200  μg/mL AGE-BSA 的巨噬细胞中,RAGE TLR4 沉默显著抑制 ERK 磷酸化(图3 a)并降低 FOXC2 Dll4 的表达水平(图3 b)。


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图3
(a)ERK 和 p-ERK 的免疫印迹显示在左图中。列表示巨噬细胞中 ERK 的相对磷酸化水平。
(b)FOXC2、Dll4 和 GAPDH 的免疫印迹。右图的列表示巨噬细胞中 FOXC2 和 Dll4 的相对表达水平。


RAGE/TLR4 通路的沉默削弱了 AGE 暴露的巨噬细胞在接触共培养模型中诱导 VSMC 收缩-合成表型转换的能力
已建立的接触式和非接触式共培养模型在图4 a。如图4 b,在非接触模型中,AGE-BSA 暴露和 AGE-BSA 未暴露的巨噬细胞均未能改变 VSMC 中的 MYH11 表达。然而,在接触模型中,AGE-BSA 暴露的巨噬细胞显著诱导 VSMC 表型转换,这可以通过 VSMCs 中 MYH11 表达的改变来证明。如图4 c 所示,在接触共培养模型中,与 RAGE 和 TLR4 沉默的 AGE-BSA 暴露的巨噬细胞共培养的 VSMCs 表现出 NICD1 和 HES 的表达水平降低,这是 Notch 信号通路激活的标志物。然而,在非接触模型中,NICD1 和 HES1 的表达水平在 VSMCs 中没有改变(图4 d)。


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图4
(a)非接触和接触式共培养模型示意图。
(b)捕获的 MYH11 的免疫荧光染色图像,还演示了 DAPI 及其合并图像。右列分别表示 MYH11 在接触和非接触共培养模型中的平均荧光强度。
(c)非接触共培养模型中,巨噬细胞中的 Dll4、GAPDH 和 VSMCs 中的 HES1、NICD1 和 GAPDH 的免疫印迹。列表示非接触共培养模型中巨噬细胞中的Dll4和VSMCs 中HES1 和 NICD1 的相对表达水平。
(d)接触共培养模型中巨噬细胞中 Dll4、GAPDH 和 VSMCs 中 HES1、NICD1 和 GAPDH 的免疫印迹。列表示接触共培养模型中巨噬细胞中的Dll4和VSMCs 中HES1 和 NICD1 的相对表达水平。

总之,该研究数据提出了一种新的分子机制来解释 DM 如何加剧 AS。DM 促进的 AGEs 诱导斑块巨噬细胞中 RAGE/TLR4 通路的激活,这些通路执行 M1 极化。在此过程中,激活的 RAGE/TLR4 信号通过 ERK/FOXC2 通路在该斑块 M1 巨噬细胞亚群中促进 Dll4 表达。AGE 处理的巨噬细胞通过在接触共培养模型而不是非接触模型中激活 Notch 通路诱导 VSMC 表型转化,从而促成 AS。抑制 TLR4 信号使M1巨噬细胞失去 Dll4 高表达表型。因此,VSMC 表型转换被抑制,糖尿病加重的 AS 被减弱。


参考文献:Xing Y, Pan S, Zhu L, Cui Q, Tang Z, Liu Z, Liu F. Advanced Glycation End Products Induce Atherosclerosis via RAGE/TLR4 Signaling Mediated-M1 Macrophage Polarization-Dependent Vascular Smooth Muscle Cell Phenotypic Conversion. Oxid Med Cell Longev. 2022 Jan 13;2022:9763377. doi: 10.1155/2022/9763377. PMID: 35069982; PMCID: PMC8776434.原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/35069982/
图片来源:所有图片均来源于参考文献


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