G蛋白偶联雌激素受体通过抑制Piezo1减轻机械应力介导的骨关节炎软骨细胞凋亡

G蛋白偶联雌激素受体通过抑制Piezo1减轻机械应力介导的骨关节炎软骨细胞凋亡

骨关节炎(OA)是一种以关节软骨变性、软骨下骨硬化和骨赘形成为特征的慢性退行性关节疾病。由于软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,软骨细胞存活率的下降会导致关节软骨的退变。除了遗传和环境因素外,机械应力在骨关节炎的发病机制中发挥重要作用。先前的研究报道,机械应力上调了一种新型机械敏感离子通道 Piezo1 在软骨细胞中的表达,进而增加了软骨细胞的凋亡,最终导致软骨退化。因此,探究参与调节机械应力诱导的Piezo1激活过程的分子就尤为关键。


机械应力的信号转导途径已被广泛研究。在机械应力下,细胞膜会发生结构变化,引起细胞内相关分子的活化及对应信号转导通路的激活。作为对机械应力的反应,Yes 相关蛋白(YAP,一种转录共刺激因子)的亚细胞定位从细胞核转移到细胞质。细胞质 YAP 下调 Rho GTPase 酶激活蛋白29ARHGAP29)的表达,该蛋白被称为 RhoA/LIMK/cofilin 通路的调节因子。Cofilin 是一种肌动蛋白结合蛋白。Cofilin 调节的聚合肌动蛋白增强了 Piezo1 的激活,最终增加了软骨细胞的凋亡。然而,机械应力介导的信号通路的调节,特别是上游分子的调节,尚未阐明。


雌激素受体包括细胞质或细胞核中的常规雌激素受体(ERs)和新型G蛋白偶联雌激素受体(GPERs),它们通过快速非基因组通路和慢速基因组通路发挥调节功能。雌激素受体调节细胞增殖、凋亡和代谢,暗示雌激素受体在维持细胞内稳态中的重要作用。先前的研究表明,在雌激素处理后,机械应力诱导的软骨细胞凋亡显著降低。然而,目前,可能与 OA 发展有关的机械应力相关的雌激素受体类型仍不清楚。


青岛大学附属医院关节外科及药剂科、潍坊市中医院关节骨科联合团队的一项研究探讨了软骨细胞中机械应力相关的雌激素受体,并试图辨别与机械应力介导的信号通路密切相关的雌激素受体类型,并探讨它们在 OA 过程中对软骨细胞凋亡的潜在影响。


G蛋白偶联雌激素受体通过抑制Piezo1减轻机械应力介导的骨关节炎软骨细胞凋亡



Piezo1 沉默后,GPER 在暴露于机械应力的软骨细胞中上调


为了探索与 Piezo1 相互作用的分子和调控网络,实验检测了转染Piezo1-siRNA后加载机械应力的软骨细胞转录谱的变化。在体外多通道细胞牵张应力加载系统中,加载24 h的周期性牵张应力,膜性六孔板每孔底部硅胶膜的形变幅度为20%,周期为10/min当显著的基因表达差异被分组并可视化为热图时,沉默 Piezo1 会导致雌激素相关的转录特征(图1 a)。进一步研究表明,新型雌激素受体 GPER Piezo1 沉默后显著上调,而常规 ERα ERβ 没有显著变化。疾病和功能分析表明,差异基因主要参与细胞死亡和存活,表明 Piezo1 参与机械应力对软骨细胞存活的调控过程(图1 b)。mRNA表达测量确定GPER随着Piezo1-siRNA的转染而增加(图1 c)。Weste blot 结果与 mRNA 表达一致(图1 d)。


G蛋白偶联雌激素受体通过抑制Piezo1减轻机械应力介导的骨关节炎软骨细胞凋亡


1 Piezo1 沉默后,GPER 在暴露于机械应力的软骨细胞中上调。

a)在暴露于机械应力的软骨细胞中 Piezo1 沉默后差异基因表达值的热图。(b)在暴露于机械应力的软骨细胞中,Piezo1 沉默后差异基因表达值的疾病和功能分析。(cRT-qPCR 分析 Piezo1 沉默软骨细胞与非沉默软骨细胞中的 GPER 基因。(d)与非沉默软骨细胞相比,Piezo1 沉默的软骨细胞中 GPER 的蛋白质表达。




GPER 表达在人骨关节炎软骨中降低


为了探究GPEROA的影响,实验检测了OA关节软骨组织和对照关节组织中GPERmRNA表达。与对照组相比,定量 mRNA 表达显示,骨关节炎关节软骨中的 GPER 显著降低(图2 a)。为了进一步证实 GPER 与骨关节炎软骨退变之间的关系,通过蛋白质印迹法测量了蛋白质水平(图2 b),并得到一致的结果。此外还在人软骨组织中研究了 GPER 表达。免疫组织化学染色和 GPER 的相应定量显示,与对照软骨相比,GPER 在退行性软骨中显著下调(图2 c)。


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2 GPER 表达在人骨关节炎软骨中降低。

a)与对照软骨相比,退行性软骨中 GPER 基因的RT-qPCR 分析。(b)与对照软骨相比,退行性软骨中 GPER 的蛋白质表达。(c)在没有(对照)和有抗 GPER 抗体(的情况下对退行性软骨和对照软骨进行免疫组织化学染色。




GPER的激活减少了机械应力诱导的软骨细胞凋亡


细胞活力和凋亡相关蛋白(Bcl-2 Bax)的表达用于评估软骨细胞的凋亡。暴露于 24 h 机械应力的软骨细胞凋亡增加,其特征是细胞活力显著下降、BAX 表达增加和 Bcl-2 表达减少。当暴露于 24 h 机械应力的软骨细胞用 8 μM 雌激素处理时,发现细胞凋亡减少。然而,单独的雌激素处理并未对软骨细胞存活率产生影响。G15 GPER 的抑制剂,减弱了雌激素对机械应力诱导的软骨细胞凋亡的抑制作用。这些结果表明,GPER 而非 ER 介导了雌激素的抗凋亡作用。为了进一步证明GPER对减轻机械应力诱导的细胞凋亡的作用,使用siRNA敲除了GPER。结果表明,GPER-siRNA有效阻断了雌激素的抗细胞凋亡作用,这与抑制剂应用的结果一致。



此外还探讨了GPER的特异性激动剂G-1 在机械应力诱导的软骨细胞凋亡中的潜在作用。单独使用 G-1 处理不会导致细胞凋亡显著增加。与机械应力组相比,G-1-机械应力组的存活率增加。然后确认了 G-1 是否通过 GPER 激活来改善软骨细胞凋亡,发现G-1的抗软骨细胞凋亡作用可被有效阻断。这些结果说明G-1模拟雌激素的作用降低机械应力介导的OA软骨细胞凋亡。




GPER 抑制机械应力介导的肌动蛋白聚合和 Piezo1 激活


为了揭示 GPER 在机械应力诱导的肌动蛋白聚合和 Piezo1 激活中的作用,用 G-1 或机械应力处理软骨细胞。与对照组相比,机械应力上调了软骨细胞中 Piezo1 的荧光强度。然而,G-1 处理可以显著减弱该过程中增加的荧光强度(图3 a)。Piezo1 的激活与肌动蛋白聚合密切相关。为了阐明肌动蛋白的作用,用肌动蛋白抑制剂 CytoD 处理软骨细胞。与机械应力组相比,CytoD 处理的软骨细胞中 Piezo1 的表达降低(图3 a),细胞活力和Bcl-2的表达增加,而BAX的表达减少(图3 bc)。与机械应力处理的细胞相比,G-1-机械应力处理的软骨细胞具有显著降低的肌动蛋白荧光强度(图3 a),表明 GPER 通过肌动蛋白解聚抑制机械应力介导的 Piezo1 激活。


G蛋白偶联雌激素受体通过抑制Piezo1减轻机械应力介导的骨关节炎软骨细胞凋亡


3 GPER 抑制机械应力介导的肌动蛋白聚合和 Piezo1 激活。

a)免疫荧光染色 F-肌动蛋白和 Piezo1。(b)用机械应力、10 μM G-1 8 μM cytoD 处理的软骨细胞的细胞活力。(c)对于用机械应力、10 μM G-1 8 μM cytoD 处理的软骨细胞,Bax Bcl-2 的蛋白质表达。




GPER 通过 YAP-ARHGAP29-RhoA-LIMK-Cofilin 信号通路调节肌动蛋白聚合


为了确认 YAP 是否参与机械应力诱导的细胞凋亡,使用 siRNA 敲除来抑制 YAP。结果表明,YAP-siRNA 有效阻断了 G-1 的抗凋亡作用。这些结果表明,YAP 在由 G-1 和机械应力调节的细胞凋亡中发挥作用。此外,探讨了 YAP 是否对肌动蛋白聚合和相关信号通路具有潜在的调节作用。免疫荧光结果表明,YAP 沉默有效地减弱了 G-1 诱导的 GPER 激活所导致的肌动蛋白解聚和 Piezo1 的失活。作为肌动蛋白聚合相关信号通路的重要调节分子,ARHGAP29通过促进与GTP结合的(活性的)RhoA向其GDP结合(非活性)形式的转化而降低RhoA的活性,进而抑制与肌动蛋白聚合密切相关的LIMK/Cofilin途径。研究数据显示,与对照组相比,机械应力组ARHGAP29蛋白的表达明显降低,RhoA活性、LIMK活性和cofilin磷酸化水平升高,可以通过G-1处理来挽救。总之,GPER可通过YAP-ARHGAP29-RhoA-LIMK-Cofilin信号抑制机械应力所致的肌动蛋白聚合和Piezo1的激活。




G-1激活的GPER在体内抑制关节软骨退化


通过构建骨关节炎大鼠模型评估关节软骨退行性变程度(图4 a),OARSI 评分数据显示,OA + NC 组的关节软骨退化比 Sham + NC 组更严重,G-1 处理减弱了这一病理过程。此外使用了 GPER YAP 的免疫组织化学染色。如图4 bG-1处理可以增强大鼠关节软骨中YAP的表达。这些数据表明,关节内注射 G-1 在体内具有潜在的保护作用。


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4 G-1 激活的 GPER 在体内抑制关节软骨退化。

a)番红固绿染色各组关节软骨及OARSI评分。(b)免疫荧光染色 GPER YAP




总而言之,该研究通过揭示 GPER 是机械应力介导的 Piezo1 激活的关键调节剂,并通过 YAP/ARHGAP29/RhoA/LIMK/cofilin 途径机械触发 OA 进展过程中的软骨细胞凋亡,从而提出了一种新的调节和控制机制,并阐明 GPER 作为 OA 治疗靶点的潜在应用价值。




参考文献:Sun Y, Leng P, Guo P, Gao H, Liu Y, Li C, Li Z, Zhang H. G protein coupled estrogen receptor attenuates mechanical stress-mediated apoptosis of chondrocyte in osteoarthritis via suppression of Piezo1. Mol Med. 2021 Aug 28;27(1):96. doi: 10.1186/s10020-021-00360-w. PMID: 34454425; PMCID: PMC8403401.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34454425/


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