结直肠癌相关成纤维细胞通过NECTIN2信号抑制效应T细胞

结直肠癌（CRC）是最常见和最致命的癌症之一。CRC具有异质性肿瘤微环境，具有独特的成纤维细胞群。肿瘤生长和进展的过程与肿瘤相关成纤维细胞（CAF）有关。据报道，CAF调节炎症细胞的募集，并影响血管生成、肿瘤干性和耐药性。因此，CAF在很大程度上促进了癌症的进展，被认为是治疗的重要靶点。

尽管在胰腺导管腺癌、乳腺癌和肺癌中对CAF的表征方面取得了进展，但仍缺乏对结直肠癌CAF的quanmian分析。研究已经报道了两种主要的CAF亚型，它们要么表达细胞外基质（ECM）分子和调节剂（称为CAF-A），要么表达肌成纤维细胞的标志物（称为CAF-B）。此外，CRC CAF特征与预后不良相关。然而，由于以往的研究主要集中在分析CRC的整体细胞组成上，因此对CAF亚型的广泛分析受到测序CAF数量相对较少的阻碍。CAF在CRC中起着核心作用，目前仍缺乏对CAF异质性的quanmian分析。

最近，在德国哥廷根大学医学中心的一项研究中，通过结合单细胞RNA测序（scRNA seq）和空间蛋白质组学，对人类结肠和CRC组织样本中的成纤维细胞异质性进行了深入分析，发现并命名了一种新的亚型TinCAF，证明了TinCAF特征标志物的高表达与CRC患者的fufa无生存期缩短有关。这种新发现的CAF可能代表了未来CRC免疫疗法的潜在靶点。研究成果发表在Cancer Letters期刊题为“Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling”。

首先，研究人员quanmian分析了成纤维细胞的异质性，通过对8个不同样本（6个CRC样本，2个正常结肠样本）进行scRNA-seq（图1 A、B），发现成纤维细胞聚集成了11个不同的簇（图1 C）。有趣的是，大多数簇在正常样本和CRC组织中都被发现（图1 D），然而，簇3、5、7和9几乎只存在于CRC组织中，因此代表了CAF特异性簇。

基于对差异表达标记基因的分析，已知的成纤维细胞亚型，如apCAF（簇1）、“上皮维持”成纤维细胞（簇2）、myCAF（簇3）和iCAF（簇7）被鉴定出来（图1 E）。簇9显示MKI67、CENPF、CDK1和其他细胞周期相关基因的高表达，表明该簇为增殖成纤维细胞的区室。簇5不表达已知的CAF特征标记物，但显示出免疫相关基因的表达，如CD40、CD276和NECTIN2（图1 E）。这证明了人类正常结肠组织和CRC组织中的成纤维细胞异质性，揭示了已知的CAF亚型，但鉴定了一种新的CAF簇。

为了进一步分析簇5及其潜在的功能特征，利用基因集富集分析（GSEA），发现其中富集的基因集与干扰素反应和氧化磷酸化相关，表明这些CAF具有免疫反应和代谢活性（图1 F）。进一步评估差异表达基因，注意到与免疫调节相关的其他基因，如CD39、CD59、CAV1、MIF和Notch3（图1 G）。这些数据说明，簇5成纤维细胞与癌症相关，但与已知的CAF亚群不同，并显示出免疫调节基因表达谱。

当比较同一患者CRC成纤维细胞和正常组织中簇-特征标志物的蛋白质表达水平时，发现了差异表达，证实了成纤维细胞的异质性和蛋白质组学水平上的CAF特异性特征。由于新发现的簇5特别令人感兴趣，研究人员更仔细地分析了簇5蛋白标记物NECTIN2（CD112）的表达，发现NECTIN2表达仅在肿瘤微环境中发现，主要与表达CD90的成纤维细胞亚群共定位，但不在上皮肿瘤细胞上表达。

图1结直肠癌和结肠成纤维细胞的转录组异质性。

由于簇5与免疫细胞和T细胞相互作用性状相关，因此，实验接下来分析了CAF标记蛋白与T细胞相关的表达模式。结果表明，所有CAF相关标志物在接近T细胞的成纤维细胞中的表达水平均显著升高。这些发现指出了T细胞和CAF之间的密切相互作用，并暗示了T细胞可能影响TME中某些CAF的募集和分布的可能性。

空间蛋白质组学分析表明，CAF和肿瘤浸润性T细胞之间存在密切的相互作用。因此，使用共培养试验评估了结直肠癌衍生的CAF对T细胞的影响。首先，使用流式细胞术在不同患者的原代CAF培养物中检测到簇5 CAF的6个特征蛋白标记物（图2 A、B），并证实了共表达（图2 C），表明簇5 CAF的表型在原代培养物中得以维持。

然后将原代CAF与T细胞共培养三天以表征CAF和T细胞之间的相互作用（图2 D）。尽管在整个共培养过程中不断刺激T细胞，但CAF显著降低了T细胞活力和增殖，证明了CRC CAF对T细胞的抑制特性（图2 E）。CD4辅助性T细胞显示CD69和TIM-3表达增加，其他测试标志物没有显示出明显的趋势（图2 F）。在CD8细胞毒性T细胞中，CD69和TIM-3在CAF存在下也显著上调。然而，CD25、CD137和PD-1显著下调（图2 F）。这些数据表明，CAF可以在体外破坏T细胞的活化并抑制其增殖。

此外，分析了共培养后的CAF表型以评估直接T细胞相互作用引起的可能调节。值得注意的是，CAF在共培养的三天内显著上调了VCAM1以及簇5特异性CAF蛋白标记物NECTIN2和CD40（图2 G），表明T细胞可以直接调节CAF的表型，正如空间蛋白质组学所揭示的那样。CD40是T细胞活化标志物CD154（CD40L）的受体，而NECTIN2可以结合T细胞表达的多种受体，表明簇5 CAF直接参与CRC中T细胞反应的协调。

图2 CAF-T细胞相互作用的功能分析。

实验假设CRC CAF可以通过上调簇5蛋白标志物NECTIN2和CD40来抑制T细胞增殖和活化。为了研究这些标记物的作用，在共培养实验中应用了阻断受体-配体结合的功能性抗体。在T细胞激活后，大多数T细胞获得了效应记忆或效应记忆重新表达CD45RA表型，而只有20-30%的T细胞表现出幼稚表型（图3 A）。与CAF的直接相互作用显著降低了T+ EM 的丰度和TEMRA 细胞，而大约60-80%的T细胞保留在幼稚T细胞状态。此外，在抗体介导的阻断是NECTIN2而不是CD40时，CAF的抑制作用被完全消除。

对与CAF共培养的T细胞的活化和损耗标志物表达的分析显示出异常表型（图3 B）：与单独使用T细胞相比，活化和耗竭标志物均增加。相比之下，CD40和更明显的NECTIN2阻断显著降低了CD25、TIM-3、LAG3和PD1的表达，表明这两种CAF标志物都是抑制作用所必需的。在CD8 T细胞中，NECTIN2阻断的作用更为明显，表明NECTIN2是CD8 T细胞耗竭的关键调节因子。虽然阻断NECTIN2对T细胞活化和分化有显著影响，但NECTIN2受体的表达不受影响，这表明对T细胞的影响确实主要由NECTIN2介导。

为了研究簇5 CAF特异性基因表达的临床相关性，研究人员在1342例结肠癌患者的公开临床数据库中评估了NECTIN2、CD40和CD248的表达，发现NECTIN2高表达患者的预后明显差于低NECTIN2表达的患者。同样，CD40或CD248的高表达也是该患者队列中的不良预后因素。此外，NECTIN2、CD40和CD248的高表达仅在158例微卫星稳定型（MSS）患者中与无fufa生存期（RFS）的显著降低相关，而在微卫星不稳定型（MSI）高表达患者中不相关。

鉴于簇5 CAF标志物NECTIN2的显著预后价值，实验测试了其表达与其他肿瘤实体临床结果的相关性，结果证实了在乳腺癌、肺腺癌、胃癌以及急性髓系白血病和多发性骨髓瘤中，高NECTIN2表达是患者预后不良的因素。这些数据强调了NECTIN2作为免疫治疗潜在靶点的临床相关性和预后价值。

图3阻断CD40或NECTIN2调节共培养后的T细胞表型和耗竭。

图4研究对人类结直肠癌和结直肠癌患者正常结肠组织中的成纤维细胞异质性进行了quanmian分析，确定了11个成纤维细胞亚群（图4 a）。其中，发现了先前描述的亚群，例如myCAF-样，iCAF-样，apCAF-样和“上皮维持”成纤维细胞。四个亚群几乎只存在于CRC组织中，因此代表了CRC CAF。研究鉴定了一种新的CAF亚群，基于其T细胞抑制和耗竭诱导特征，将其命名为T细胞抑制性CAF（TinCAF）（图4 b）。

综上所述，该研究认为这种新型NECTIN2-阳性CAF亚型是抑制TME的重要参与者，也是下一代免疫检查点抑制剂的潜在新靶点。这些抑制剂可能是一个有价值的选择，特别是在MSS肿瘤中。

参考文献：Agorku DJ, Bosio A, Alves F, Ströbel P, Hardt O. Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling. Cancer Lett. 2024 Jul 28;595:216985. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216985. Epub 2024 May 29. PMID: 38821255.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38821255/

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