NADPH 氧化酶4 在缺氧条件下介导内皮功能

氧气供应不足是许多疾病的一个特征，尤其是心血管系统的疾病。大多数细胞对缺氧的反应是由缺氧诱导因子（HIF）介导的。这些异二聚体转录因子由一个 α亚基和一个 β亚基组成，能够与缺氧反应元件（HRE）结合，进而能够调节大量基因，以应对低氧水平或低氧应激。

一些研究支持缺氧和 NADPH 氧化酶4（NOX4）之间存在串扰。因此，缺氧已被证明可在肾、脑、肺、肺动脉平滑肌细胞和肺动脉高压患者的外膜成纤维细胞中诱导 NOX4。NOX4 属于 NADPH 氧化酶家族的成员之一，NADPH 氧化酶是血管中活性氧的主要来源，与各种心血管疾病密切相关。例如，它们在衰老相关的内皮功能障碍发展中发挥作用，并导致糖尿病的血管并发症。

据报道，NOX4 可由前列腺素I2 （PGI2）（通常称为前列环素）信号诱导。PGI2 是一种由花生四烯酸代谢产生的脂质激素，主要在血管内皮细胞、平滑肌细胞合成，具有扩张血管、抑制血小板聚集的功能，在维持血管稳态中起着至关重要的作用。尽管 PGI2 在缺氧条件下血管舒张中的作用已被确认，但在缺氧条件下，NOX4 和 PGI2 之间的关系尚未明确。此外，内皮细胞会在缺氧下利用氧气产生过氧化氢的原因也令人困惑。

因此，德国德累斯顿工业大学医学院及附属医院内脏及胸血管外科的课题组在一项研究中阐明了 NOX4 在缺氧下的作用，特别是与 PGI2 的关系。研究成果发表在 Antioxidants 期刊题为“NADPH Oxidase 4: Crucial for Endothelial Function under Hypoxia—Complementing Prostacyclin”。

研究人员将 NOX4 mRNA 的表达与人血管中前列腺素I2 合酶（PTGIS）的表达相关联。从外周动脉疾病患者中获取闭塞近端动脉壁样本，在极有可能缺氧的动脉壁中，观察到 NOX4 表达与 PTGIS mRNA 表达之间存在紧密相关性。然而，在冠状动脉旁路移植术后患者左乳内动脉中，这些动脉不受闭塞的影响，也未发现 NOX4 和 PTGIS mRNA 表达之间的相关性。

此外，原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在缺氧 8 小时后 NOX4 表达显著增加，并在 16 小时和 24 小时持续升高（图1 A）。这伴随着缺氧后过氧化氢（H2O2）释放的增加，但这在具有 shNOX4 的细胞中被消除（图1 B）。同时，来自野生型（WT）小鼠的主动脉在缺氧 24 小时后显示 Nox4 mRNA 表达升高（图1 C）。

在 HUVECs 中，缺氧 24 小时后 PTGIS 的 mRNA 表达显著上调（图1 D），上清液中 PGI2 无酶促反应水解生成的 6-keto-PGF1α 浓度增加（图1 E）。WT 小鼠的主动脉显示，缺氧后 PTGIS mRNA 表达显著上调，这在 Nox4-/- 小鼠的主动脉中也非常显著（图1 F）。放线菌素D 的实验表明，在常氧和缺氧条件下，NOX4 mRNA 和 PTGIS mRNA 的降解没有显著差异（图1 G、H）。这些证据证明，响应缺氧的 NOX4 和 PTGIS 的 mRNA 水平的调节是在基因转录水平上控制的，而不是通过 mRNA 稳定性等转录后过程来控制的。

图1 缺氧后人内皮细胞和小鼠主动脉中NOX4和PTGIS表达增加。

DMOG 是可渗透入细胞的 HIF-1α 脯氨酰羟化酶（HIF-PH）竞争性抑制剂。在常氧条件下，用 DMOG 处理人内皮细胞会增加内源性缺氧诱导因子（HIF）水平。在 DMOG 应用后检测到内皮细胞中 NOX4（图2 A）和 PTGIS（图2 D）表达升高，表明 NOX4 和 PTGIS 在缺氧下表达的上调具有 HIF 依赖性。在缺氧下抑制亚基 HIF1a 导致 NOX4 表达降低（图2 B），但 PTGIS 表达没有降低（图2 E）。然而，抑制 HIF2a 显著阻止了 PTGIS 在缺氧下的上调（图2 F），而 NOX4 不受影响（图2 C）。这表明，NOX4 和 PTGIS 受不同 HIFs 的调控。

接下来，评估缺氧和 Nox4 对血管功能的影响，分析了 WT 和 Nox4-/- 小鼠肠系膜动脉的血管功能。WT 小鼠在缺氧条件下血管内皮舒张功能下降，还检测到过氧化氢释放增加，但 Nox4-/- 小鼠没有发现。当在缺氧条件下用过氧化氢清除剂过氧化氢酶孵育 WT 肠系膜动脉时，内皮功能进一步改变。此外，与 WT 小鼠相比，Nox4-/- 小鼠肠系膜动脉内皮依赖性血管舒张进一步下降。

下一步，将缺氧条件下 WT 小鼠的肠系膜动脉与环氧合酶抑制剂双氯芬酸一起孵育，深入了解前列腺素的影响，发现其血管舒张不受双氯芬酸的影响。然而，与过氧化氢酶和双氯芬酸联合孵育的 WT 小鼠的肠系膜动脉显示出了内皮功能障碍。同样，在缺氧条件下，Nox4-/- 小鼠肠系膜动脉用双氯芬酸孵育后，内皮功能障碍加剧。用一氧化氮合酶抑制剂 L-NAME 孵育肠系膜动脉表明，同样在缺氧条件下，内皮依赖性血管舒张主要由一氧化氮介导，尽管这种影响在 Nox4-/- 小鼠的肠系膜动脉中显著增加，表明 Nox4 与内皮依赖性血管舒张相关。此外，用过氧化氢酶和 L-NAME 孵育 HUVECs 显示 eNOS mRNA 表达下调。这些数据表明，Nox4 释放的过氧化氢在缺氧下可维持内皮功能。

图2 NOX4 和 PTGIS 受不同 HIFs 的调控。

为了研究保护性血流如何影响 NOX4 和 PTGIS 在缺氧下的上调，在缺氧条件结合 30 dyn/cm2 的高幅度层流下培养人内皮细胞以模拟恢复的血流。当内皮细胞在层流条件下处理 24 小时和 48 小时时，缺氧条件下，NOX4 的上升趋势明显降低（图3 A、B）。同样，PTGIS mRNA 表达也显著降低（图3 C、D）。相比之下，当在缺氧条件下施加剪切应力时，已知诱导 eNOS 表达的层流剪切应力仍导致 eNOS mRNA 表达上调（图3 E、F）。然而，在缺氧条件下，由于层流刺激，eNOS 蛋白表达和一氧化氮释放仅趋于增加（图3 E、G）。相反，在那些施加额外层流的缺氧内皮细胞中，观察到 HIF1a 蛋白表达显著降低（图3 F）。这些结果表明，恢复的层流可阻止缺氧条件下 NOX4 和 PTGIS 的上调。

图3 30 dyn/cm2 的层流作用于人内皮细胞，可阻止缺氧条件下 NOX4 和 PTGIS 的上调。

目前的研究提供了缺氧条件下 NOX4 和 PGI2 产生 PTGIS 酶相关的证据，观察到 NOX4 受 HIF1a 调控，而 PTGIS 受 HIF2a 诱导。表明了NOX4 在缺氧下介导内皮功能，从而补充血管中 PGI2，而层流剪切应力恢复了 eNOS 表达并减弱了缺氧下 NOX4 和 PTGIS 的反应。总之，该研究证明了NOX4 对于确保缺氧下内皮依赖性血管舒张至关重要。因此，NOX4 作为过氧化氢的主要来源之一，可能有助于增强血管功能，恢复缺氧条件下的血液循环。目前探索用于治疗纤维化和某些癌症等疾病的 NOX4 抑制剂可能需要验证其心血管副作用。

参考文献：Brendel H, Mittag J, Hofmann A, Hempel H, Giebe S, Diaba-Nuhoho P, Wolk S, Reeps C, Morawietz H, Brunssen C. NADPH Oxidase 4: Crucial for Endothelial Function under Hypoxia-Complementing Prostacyclin. Antioxidants (Basel). 2024 Sep 27;13(10):1178. doi: 10.3390/antiox13101178. PMID: 39456432; PMCID: PMC11504732.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39456432/

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