肌腱蛋白X（TN-X）介导血流诱导的内皮-间充质转化和动脉粥样硬化抑制

动脉粥样硬化是一种累及大中型动脉的慢性、进行性、炎症性疾病，最终可导致急性心血管事件，如心肌梗死和中风。众所周知，层流和扰动流会激活内皮细胞中不同的信号转导通路，分别导致抗动脉粥样硬化表型和致动脉粥样硬化表型。最近，体外和体内研究表明，暴露于扰动流的内皮细胞经历内皮-间充质转化（EndMT），这通过细胞间粘附的溶解、细胞极性的改变和间充质标志基因的表达来促进动脉粥样硬化的发展。与扰动流相反，单向层流抑制 EndMT。TGF-β（转化生长因子β）是驱动 EndMT 的核心介质，内皮 TGF-β 已被证明与动脉粥样硬化的进展有关。然而，人们对内皮 TGF-β 信号在动脉粥样硬化发展过程中如何激活以及层流和紊乱血流如何调节内皮 TGF-β 信号传导知之甚少。

肌腱蛋白X（TN-X，tenascin-X）是 tenascin 家族的细胞外基质糖蛋白，可形成同源三聚体，并具有多结构域结构。缺乏该蛋白会导致经典型艾勒斯-当洛综合征，即弹性蛋白或胶原蛋白结构异常，引起皮肤、关节和血管的脆弱性增加。

基于此，德国马克思普朗克心肺研究所、法兰克福歌德大学分子医学中心及中国西安交通大学医学部基础医学院心血管研究中心的研究团队于 Circulation Research 期刊在线发表了题为“Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis”的研究成果，表明内皮细胞响应单向层流表达 TN-X，并通过结合 TGF-β 抑制内皮细胞中 TGF-β诱导的信号，从而介导对 EndMT 和动脉粥样硬化的保护。

首先，为了鉴定被层流上调的基因，将人脐静脉内皮细胞保持在静态条件或暴露于单向层流（12 dynes/cm2，48 h），发现 >500个基因发生变化，除了众所周知的流量依赖性表达基因（如 KLF2 和 KLF4）外，还发现其他几个基因被强烈上调，包括编码细胞外基质糖蛋白 TN-X 的 TNXB (图1 A）。与静态条件下的低表达相比，暴露于层流 24 小时导致其 RNA 和蛋白质水平强烈上调（图1 B、C）。虽然单向层流增加了 TNXB 表达以及包括 KLF2 和 KLF4 在内的其他血流依赖性基因的表达（图1 B），但诱导炎症基因（包括 CCL2 和 VCAM1）表达的振荡流（4 dynes/cm2，1 Hz）不会诱导 TNXB 或 KLF2 和 KLF4 的表达（图1 D、E）。

然后，测试了几种机械感应和机械信号蛋白，如 PIEZO1、ERK5、KLF2 和 KLF4 的敲低是否影响层流诱导的 TNXB 表达，发现虽然敲低 PIEZO1、ERK5 和 KLF2 对层流诱导的 TNXB 上调没有影响，但抑制 KLF4 表达降低了层流诱导的 TNXB 表达。进一步分析表明，KLF4 与至少 2 个结合位点的结合在流动反应中增加，其中一个结合位点发生突变时，导致层流诱导的 TNXB 启动子激活完全丧失，表明其在介导 KLF4-依赖性 TNXB 表达调控中的关键作用。以上这些数据表明，层流诱导的 TNXB 表达是由 KLF4 介导的。

为了测试层流是否也在体内诱导 TNXB 表达，分析了在 Tnxb 启动子控制下表达 β-半乳糖苷酶的小鼠细胞系。在主要暴露于单向层流的主动脉弓外曲率内皮中，β-半乳糖苷酶活性明显高于血流受干扰的主动脉弓内曲率内皮（图1 F）。对内皮细胞特异性 TN-X 缺失小鼠进行分析，发现培养基中 TN-X 的染色不受 TN-X 内皮丢失的影响。在人主动脉切片中，还发现 TNXB 在层流区域（如降主动脉）的内皮层中高表达，而在主动脉弓内曲率的内皮表达相对较低（图1 G、H）。此外，人主动脉内皮细胞 TNXB 的表达与 VCAM1 的表达呈负相关（图1 G、I）。这些数据表明，当体外和体内暴露于单向层流剪切应力时，内皮细胞的 TNXB 表达强烈增加。

图1 层流剪切应力诱导内皮 TN-X（tenascin-X）的表达。

为了研究体内条件下的内皮 TN-X 功能，研究了 EC-Tnxb-KO 小鼠。两周后，观察到 Vcam1 表达和内皮下 CD68 阳性细胞的数量都强烈增加。这些改变不仅在主动脉弓的内曲率中观察到，而且在外曲率中也观察到。继续进行部分颈动脉结扎术诱导内皮功能障碍和动脉粥样硬化，发现小鼠内皮细胞特异性 TN-X 丢失导致颈动脉新内膜形成强烈增加。16 周后，小鼠的主动脉、主动脉根部以及头臂动脉中动脉粥样硬化斑块的发生和进展强烈增加。在暴露于单向层流的区域（如降主动脉）和暴露于扰动流的区域（如主动脉弓的内曲率）中，都观察到动脉粥样硬化进展增加。

接下来，为了了解缺失 TN-X 的情况下内皮炎症增加的机制，分析了暴露于不同流动模式的内皮细胞的各种标志物。RT-qPCR 显示 EndMT 标志物的表达增加，如 fn1、Notch3、Vim、Mmp2、Mmp9、Fsp1、Acta2、Zeb1 和 Twist1。这伴随着 EC-Tnxb-KO 小鼠内主动脉内皮中 Smad2 的磷酸化增加，这表明在没有 TN-X 的情况下 TGF-β 信号增加。同样，在人降主动脉和主动脉弓内曲率中也发现 TN-X 表达与纤连蛋白的表达和 Smad2 的磷酸化呈负相关。

为了测试缺失 TN-X 的情况下 EndMT 和炎症标志物表达的增加以及 Smad2 磷酸化的增加是否确实是由于 TGF-β 活性的增加，用抗-TGF-β 抗体处理 EC-Tnxb-KO 小鼠。在内皮 TN-X 缺失的情况下，抑制 TGF-β 阻断了 Smad2 磷酸化增加以及 EndMT 炎症标志物表达的增加（图2 A、C），还强烈减少了小鼠部分颈动脉结扎后新内膜的形成（图2 D、E）。此外，LDL（低密度脂蛋白）受体缺陷型小鼠 TN-X 缺失的内皮细胞中动脉粥样硬化进展的增加（图2 F、G）。

为了测试内皮 TGF-β 信号是否导致 EndMT 标志物表达增加，生成 TN-X 以及 TGF-β 受体1、2丢失的小鼠，发现在 EC-Tnxb-KO 小鼠中 Smad2 磷酸化水平和纤连蛋白表达的增加降低到对照水平。此外，缺乏 LDL 受体的小鼠中观察到的新内膜形成增加，当内皮细胞中缺乏 TGF-β 受体 1 和 2 时也减少。这些数据表明，内皮细胞 TN-X 丢失后，EndMT 和炎症是由内皮细胞中 TGF-β 信号增加引起的。

图2 抑制 TGF-β 阻断 EC-Tnxb-KO 小鼠EndMT 和血管炎症的发展。

由于 TN-X 在内皮细胞中的缺失会引起典型的 TGF-β 介导的药物变化，这可以通过 TGF-β 的药理学抑制来阻断，实验假设 TN-X 抑制 TGF-β 活性或其下游信号。因此，研究人员确定了 TN-X 浓度增加对人脐静脉内皮细胞中 TGF-β 诱导的 Smad2/Smad3 磷酸化的影响，并发现 TN-X 抑制 TGF-β 的作用（图3 A）。此外，层流诱导的 TNXB 表达伴随着 TGF-β 诱导的 Smad 磷酸化强烈降低。然而，当层流诱导的 TNXB 表达被小干扰 RNA 介导的敲低阻断时，这种效果未被观察到（图3 B）。这表明内源性上调的 TN-X 也能够在体外抑制 TGF-β。

为了进一步表征 TN-X 对 TGF-β诱导的细胞效应的影响，研究了 TGF-β 与固定 TGF-β 受体在TN-X 的 C 端部分（由 5 个 FN （纤连蛋白）III 型样结构域和纤维蛋白原样结构域组成）缺失或存在的情况下的结合，发现 TN-X 以浓度依赖性方式抑制 TGF-β 与其受体的结合（图3 C）。

为了测试 TN-X 是通过与受体结合还是与 TGF-β 结合来阻断 TGF-β 与其受体之间的相互作用，进行免疫共沉淀实验分析 TN-X 与 TGF-β 及其受体的相互作用。成熟的 TGF-β 与抗-TN-X 抗体特异性共沉淀，反之亦然（图3 D），而没有观察到 TN-X 与 TGF-β 受体的细胞外部分共沉淀（图3 D），而细胞外部分很容易与 TGF-β 共沉淀。亚结构域分析显示，FBG 结构域（而不是 FN III 型样结构域）与 TGF-β 相互作用（图3 E）。这些数据强烈表明，TN-X 通过其 FBG 结构域直接与 TGF-β 相互作用，从而阻止其与 TGF-β 受体相互作用。

图3 TN-X 结合 TGF-β 并作为 TGF-β清除剂发挥作用。F：图形概要TN-X 在保护内皮细胞免受 TGF-β 诱导的 EndMT 中的流动依赖性功能的示意图。单向层流诱导内皮 TNXB 的表达。同源三聚体 TN-X 通过其 C 端 FBG 结构域与 TGF-β 结合，从而阻止 TGF-β 与其在内皮细胞上的受体结合。

总之，这项研究数据将 TN-X 确定为生理剪切应力发挥抗炎和动脉粥样硬化保护活性的核心效应子，其作用机制是抑制 TGF-β 活性和 EndMT。模拟 TN-X 介导的 TGF-β 和 EndMT 抑制可能是干扰慢性炎症性血管疾病（如动脉粥样硬化）进展的新机制。

参考文献：Liang G, Wang S, Shao J, Jin YJ, Xu L, Yan Y, Günther S, Wang L, Offermanns S. Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis. Circ Res. 2022 May 27;130(11):1647-1659. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320694. Epub 2022 Apr 21. PMID: 35443807.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35443807/

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