牙髓干细胞调节真皮成纤维细胞的炎症小体通路和胶原沉积

纤维化是一种病理状态，几乎可以影响身体的所有组织，以成纤维细胞产生的细胞外基质（ECM）的过量沉积和重塑为特征。纤维化主要由促炎细胞因子介导的慢性刺激触发。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）可以协同作用，启动炎症级联反应。这些细胞因子，除了转化生长因子（TGF）-β 外，还可由活化的巨噬细胞释放，其已被证明可以激活成纤维细胞，导致 ECM 蛋白、内皮细胞、新血管生成过程、角质形成细胞和巨噬细胞的过量产生。

基质金属蛋白酶（MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）之间的失衡，以及随之而来的胶原沉积过剩，是纤维化发生、肌成纤维细胞持续活化和慢性炎症反应的最重要因素之一。此外，炎症和组织修复的主要方面，如纤维化，也受炎症小体的调节。炎症小体是一组多聚体蛋白复合物，能够识别不同炎症诱导的刺激并控制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1（CASP-1）的活化，促进促炎细胞因子（IL-1β）和 IL-18 的成熟，导致细胞焦亡。研究最多的炎症小体是包含 NOD-、LRR- 和 pyrin 结构域的蛋白3（NLRP3）和黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）。

人牙髓干细胞（hDPSCs）是一类存在于人牙髓组织中间充质干细胞（MSCs），具有独特的特征，如高增殖率、体外和体内的广泛的分化潜力以及低免疫原性和免疫调节特性，后者通过激活不同的机制作用于免疫细胞。然而，MSCs 的免疫调节作用，特别是 DPSCs 在纤维化中的免疫调节作用，仍未被理解。

基于此，意大利摩德纳雷焦艾米里亚大学生命科学系及医学、牙科和形态学科学系团队的一项研究分析了 hDPSCs 在促炎环境中调节成纤维细胞炎症小体激活和纤维化活性的潜力，数据表明培养的成纤维细胞和 DPSCs 之间存在串扰，这似乎调节了参与炎症小体激活、ECM 沉积、伤口愈合和纤维化的基因。研究成果发表于CELLS 期刊题为“Dental Pulp Stem Cells Modulate Inflammasome Pathway and Collagen Deposition of Dermal Fibroblasts”。

首先，建立成纤维细胞和 DPSCs 共培养系统来模拟体内促炎环境，并用脂多糖（LPS）或促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-1β 的组合刺激DPSCs。LPS 处理的成纤维细胞中炎症相关基因 IL1B 转录水平的强烈增加。当与 DPSC 共培养时，与未处理的细胞相比，LPS 处理后 IL-1β 的水平增加了 102 倍，这表明 LPS 在细胞共培养时增强了 IL-1β 的表达。同时，在与 DPSC 共培养时的成纤维细胞中检测到 IL6 的显著上调，表明暴露于LPS 时 DPSCs 对 IL6 的增加有直接贡献。此外，在任何测试条件下LPS 似乎都没有显著改变 IL18 的表达。至少在某种程度上，这些影响可能归因于 TLR4 表达的调节，TLR4 表达通过 LPS 和 TNF-α + IL-1β 的刺激而增加。

当用 TNF-α 和 IL-1β 刺激与 hDPSCs 共培养的成纤维细胞时，IL1B 和 IL6 的表达急剧增加，IL-18 mRNA 表达水平也增加，但 IL-18 显示出统计学上的下调。这些数据表明，hDPSCs 可以对暴露于 TNF-α 和 IL-1β 的成纤维细胞中的促炎性 IL18 表达发挥免疫调节作用。

然后，探讨用 LPS 或 TNF-α 和 IL-1β 处理是否也可以改变炎症小体的表达并确定促炎细胞因子的更高释放。因此，评估了 AIM2、PYD 和包含 CARD 结构域（PYCARD）、NLR 凋亡抑制蛋白（NAIP）、NLRP3 和 CASP1 基因的表达，发现 LPS 处理导致仅在成纤维细胞中 AIM2 和 CASP1 的表达大幅增加，与 DPSCs 共培养将这种效果提高了三倍（图1 A）。相反，NLRP3 在成纤维细胞中几乎不表达，LPS 也不影响。

用 TNF-α 和 IL-1β 刺激导致成纤维细胞中 AIM2 的表达增加，与 DPSCs 共培养增强这种表达（图1 B）。此外，在这种情况下，NLRP3 不受 TNF-α 和 IL-1β 的影响。在成纤维细胞中单独用 LPS 或促炎细胞因子处理或与 DPSCs 共培养后，未观察到对 PYCARD 或 NAIP 表达的显著影响。在这些细胞中，无论是在基础条件下还是在刺激后，IL-1β 和 IL-18 的表达都几乎无法检测到。然而，它们确实表达了 IL-6，其水平被 TNF-α 和 IL-1β 强烈上调。

这些数据表明，用 LPS 或 TNF-α 和 IL-1β 刺激诱导成纤维细胞中促炎条件的激活，并且与 DPSCs 共培养对炎症环境有促进作用。

图1 （A）AIM2 和 CASP1 在用 LPS 处理 4 小时的成纤维细胞中相对表达，单独或与 DPSC 共培养。（B）用 TNF-α 和 IL-1β 处理 4 小时的成纤维细胞中 AIM2 和 CASP1 的相对表达，单独或与 DPSC 共培养。

为了确定基因的上调是否导致成纤维细胞释放更高的细胞因子，接下来评估了它们在刺激细胞上清液中的水平，发现用 TNF-α + IL-1β 刺激 4 小时后，单独的成纤维细胞显示 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 表达水平增加。有趣的是，相对于单独培养的刺激成纤维细胞，与 DPSCs 共培养的刺激成纤维细胞中观察到 TNF-α 显著降低和 IL-6 的上调。这些数据表明，DPSCs 本身可以调节成纤维细胞释放促炎细胞因子。

继续验证与 DPSCs 的共培养是否也能调节纤维化过程。因此，评估了一系列对胶原蛋白沉积和纤维化至关重要的基因的表达，即 TGF-β、FN1、COL1A1、COL3A1，发现无论 LPS 的刺激如何，仅与 DPSCs 共培养的成纤维细胞中 TGF-β 水平增加，这表明 DPSCs 产生了一种可以调节成纤维细胞 TGFB 转录的因子（图2）。当用 TNF-α 和 IL-1β 刺激共培养的成纤维细胞时，检测到 TGF-β 表达略有增加（图2 B）。LPS 刺激后成纤维细胞中 FN1 的表达未检测显著差异，而暴露于 TNF-α 和 IL-1β 的共培养成纤维细胞中 FN1 显著上调（图2 B）。就胶原基因而言，COL1A1 在与 DPSCs 共培养的成纤维细胞中表现出增加的趋势，而在 LPS 处理的单独成纤维细胞中则没有增加的趋势；在用 LPS 处理并与 DPSCs 共培养的成纤维细胞中观察到 COL3A1 的显著增加。此外，与未刺激的成纤维细胞相比，TNF-α 和 IL-1β 刺激诱导 COL3A1 上调，但与 DPSCs 共培养似乎降低了 COL3A1 表达。

DPSC 共培养的效应在用 LPS 或 TNF-α 和 IL-1β 刺激的成纤维细胞中触发不同的反应，特别是暴露于 LPS 诱导的增强的促纤维化环境，而当进行 TNF-α 和 IL-1β 刺激时，DPSCs 似乎调节成纤维细胞对 ECM 成分的表达。

图2 （A）编码 TGF-β 和 FN1 的基因在用 LPS 处理 4 小时的单独或与 DPSC 共培养的成纤维细胞中。（B）编码 TGF-β 和 FN1 的基因在用 TNF-α 和 IL-1β 处理 4 小时的单独或与 DPSC 共培养的成纤维细胞中。

为了进一步研究 LPS 或 TNF-α + IL-1β 刺激如何影响成纤维细胞的纤维化反应，无论是否与 DPSCs 共培养，测定了纤维化标志物 α-SMA 和纤连蛋白的表达，以及与 ECM 重塑相关的 MMP-9 的表达。

用 LPS 处理后未观察到显著变化。当用 TNF-α + IL-1β 处理时，成纤维细胞显示出 α-SMA 表达的下降趋势，与 DPSCs 共培养的成纤维细胞中纤连蛋白水平显著降低（图3 A）。数据还表明，与 DPSCs 共培养后，MMP-9 在受刺激的成纤维细胞中显著上调（图3 A）。免疫荧光分析的数据进一步证实了，当与 DPSCs 共培养时，成纤维细胞显示 α-SMA 和 COL1A1 的表达降低，FN1 的排列减少，同时 MMP-9 的表达增加（图3 B）。这些发现表明，DPSCs 在 TNF-α + IL-1β 刺激下调节成纤维细胞诱导的促纤维化表型（图3 B）。

基于上述数据，研究了 LPS 和 TNF-α/IL-1β 刺激是否影响 DPSCs 的生物学特性和表型，检测了血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）（一种典型的周细胞标志物）和 PD-L1（一种关键免疫调节分子）的表达。数据显示，LPS 和 TNF-α/IL-1β 刺激均未诱导 PDGFRβ 表达的任何显著差异，证实 DPSCs 的周细胞样性质在任何实验组中均未发生改变。有趣的是，当对单独培养和与成纤维细胞间接共培养的 DPSCs 进行 TNF-α/IL-1β 刺激时，PD-L1 表达增加。

图3 （A）用 TNF-α 和 IL-1β 处理 24 小时的单独或与 DPSC 共培养的成纤维细胞中纤连蛋白（FN1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和金属蛋白酶 9 （MMP-9） 的代表性免疫印迹和相对蛋白表达。（B）用 TNF-α 和 IL-1β 处理 24 小时单独或与 DPSC 共培养的成纤维细胞的代表性共聚焦显微镜图像。

总之，这项研究数据表明，成纤维细胞和牙髓干细胞之间存在串扰，其中后者在暴露于炎症刺激时既不改变其神经嵴相关表型，也不改变其生物学特性，并且确实调节参与炎症小体激活、ECM 沉积以及伤口愈合和纤维化的基因。值得注意的是，暴露于不同促炎刺激的牙髓干细胞可以增强参与炎症小体激活的基因的转录，而它们可以调节促纤维化环境，减少 ECM 沉积，从而有助于组织稳态的恢复。这些结果可能为进一步研究成纤维细胞和牙髓干细胞之间的时间依赖性相互作用以及牙髓干细胞在调节纤维化提供参考

参考文献：Zanini G, Bertani G, Di Tinco R, Pisciotta A, Bertoni L, Selleri V, Generali L, Marconi A, Mattioli AV, Pinti M, Carnevale G, Nasi M. Dental Pulp Stem Cells Modulate Inflammasome Pathway and Collagen Deposition of Dermal Fibroblasts. Cells. 2024 May 14;13(10):836. doi: 10.3390/cells13100836. PMID: 38786058; PMCID: PMC11120068.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38786058/

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