下腰痛（LBP） 是一种常见且经常复发的肌肉骨骼疾病，在全球范围内造成了沉重的经济负担。腰痛已成为导致残疾的主要原因和第二大就诊原因。椎间盘退变（IVD）被认为是 LBP 的主要原因，因此了解 IVD 的病理生理学具有重要意义。
IVD 是一种无血管纤维软骨组织，位于椎体之间，通过沿脊柱分布生物力学载荷而起到减震器的作用。每个 IVD 大致可以分为三个不同的区域：纤维环（AF ）位于近似椭圆柱状的 IVD外层，呈密闭的环状层状结构将凝胶状的髓核(NP)包裹在中间，薄片状的软骨终板(CEP)位于椎间盘上下两面将 AF和 NP夹在中间。
在正常生理条件下，虽然 NP 和 AF 组织的细胞数量都较低，但常驻细胞，尤其是 NP 细胞，会合成和分泌复杂的细胞外基质 （ECM） 分子来维持 ECM 稳态，抵抗机械应力，在保护IVD退行性变中起关键作用。越来越多的证据表明，机械应力，包括流体剪切应力、静水压力、压应力、牵张应力和其他机械应力，在 IVD 中 ECM 稳态的调节中起着关键的作用。在身体运动和脊柱运动期间，NP 内的组织液流入和流出以适应这些应力的变化。因此，NP 细胞不断暴露于 FSS。然而，FSS 是否以及如何调节 NP 细胞中的 ECM 稳态尚不清楚。自噬是一个高度保守和适应性的过程，包括选择性地清除和回收大量有害的细胞质物质，是维持细胞稳态的主要细胞保护系统。血红素加氧酶-1（HO-1） 已在许多组织和器官以及不同的病理生理情景中得到鉴定，是血红素降解为胆绿素、一氧化碳和铁的限速酶，可以对各种外部环境应激诱导的氧化应激、炎症和细胞死亡发挥细胞保护作用。基于此，来自华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科、中山大学第一附属医院骨科研究所、美国拉什大学医学中心骨科等专业的研究人员进行了合作研究，利用建立的大鼠NP细胞系和应力加载系统，证明适度的FSS通过调控HO-1促进细胞自噬来维持ECM稳态。相关研究成果发表在 Frontiers in Cell and Developmental Biology 题为《Moderate Fluid Shear Stress Regulates Heme Oxygenase-1 Expression to Promote Autophagy and ECM Homeostasis in the Nucleus Pulposus Cells》。
实验结果
FSS 调节大鼠 NP 细胞中 ECM 蛋白表达和 sGAG 含量
作为探索机械力调节 IVD 稳态机制的第一步，进行实验以确定 FSS 对大鼠 NP 细胞中 ECM 蛋白表达的影响。NP 细胞暴露于12 dyne/cm2 的FSS 作用0、1、2、3 和 4 小时，然后检测 sGAG 含量和几种关键 ECM 蛋白的表达。结果表明，在NP细胞中，中等大小的FSS（12 dyne/cm2）上调 sGAG 含量和合成代谢 ECM 蛋白（Col2a1 和聚集蛋白聚糖），并下调 NP 细胞中的分解代谢 ECM 蛋白（MMP13 和 ADAMTS5），而高FSS（24 dyne/cm2 ）则产生相反的效果。因此，接下来的研究重点是确定中等FSS（即 12 dyne/cm2 持续 2 小时）调节 NP 细胞中关键 ECM 蛋白表达和 sGAG 含量的潜在机制。
HO-1 在 NP 细胞中被中等 FSS 显著上调为了确定受中等FSS处理调节的基因，NP细胞用或不用FSS（12 dyne/cm2、2小时）处理，然后分离出两组的总 RNA 并进行 RNA 测序分析。结果显示，在上调基因中，发现 HO-1 在FSS处理下显著上调，p值最低。qRT-PCR 分析、蛋白质印迹和免疫荧光染色的结果进一步证实，FSS 处理显著增加了 HO-1 mRNA 和蛋白质的水平。
HO-1在中等FSS调控NP细胞ECM中起关键作用
接下来确定 HO-1 是否参与了NP 细胞中 ECM 蛋白的 FSS 调控。为此，使用阴性对照 siRNA (NC-siRNA) 和三种不同的 HO-1 siRNA（#1、#2 和 #3）转染 NP 细胞。首先用对照 siRNA 或 HO-1-siRNA (#2) 转染 NP 细胞。然后将细胞用或不用 HO-1 诱导物钴原卟啉IX (CoPP) (10 μM) 预处理 1 小时，并进行 12 dyne/cm2 FSS 处理 2 小时。
结果显示，HO-1 siRNA 显著降低了 HO-1 蛋白的水平，这被 CoPP 处理显著逆转。此外，HO-1 siRNA 显著减少了 sGAG 的合成，这被 CoPP 处理部分逆转。同样，蛋白质印迹分析的结果显示， HO-1 siRNA 下调合成代谢 ECM 蛋白（Col2a1 和聚集蛋白聚糖）的水平并上调分解代谢 ECM 蛋白（MMP13 和 ADAMTS5）的水平，这可以通过 CoPP 处理逆转。。接下来确定FSS 是否激活 NP 细胞中的自噬。结果表明，与未处理的细胞相比，用 FSS 处理的 NP 细胞显示出更高的自噬，这可以通过LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平显著增加来证明。同样，TEM 分析表明，相对于未处理的细胞，FSS 处理的细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量显著增加。此外，免疫荧光共聚焦显微镜分析显示，与未处理的细胞相比，FSS 处理的 NP 细胞中自噬体（黄点）和自噬溶酶体（游离红点）的数量显著增加。
接下来确定了 HO-1 是否在介导 NP 细胞中 FSS 诱导的自噬中起作用。在存在或不存在 HO-1 被 siRNA 敲低的情况下，NP 细胞用 FSS 处理，用或不用 CoPP 处理。
结果表明，HO-1敲低显著降低了FSS处理诱导的NP细胞中LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1表达的增加，而CoPP处理显著逆转了这种变化。TEM 分析表明，与对照 siRNA/FSS 处理的细胞相比，HO-1 siRNA 显著减少了 FSS 处理的 NP 细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量，而CoPP处理则大大逆转了这一趋势。雷帕霉素可激活多种细胞类型的自噬。因此，接下来确定了雷帕霉素处理对 FSS 处理的 NP 细胞中 HO-1 敲低诱导的自噬抑制的影响。NP 细胞首先用 HO-1 siRNA 转染，然后用或不用雷帕霉素预处理 12 小时，然后 FSS 处理 2 小时。结果表明，雷帕霉素逆转 HO-1 敲低诱导的 FSS 处理的 NP 细胞自噬和 ECM 稳态的改变。CoPP 或雷帕霉素在很大程度上逆转 FSS 处理的 NP 细胞中 IFT88 丢失引起的自噬和 ECM 稳态变化最后，实验确定了雷帕霉素或 CoPP 对 HO-1 的上调是否可以逆转 FSS 处理的 NP 细胞中IFT88 敲低引起的自噬和 ECM 蛋白表达的改变。首先用 IFT88-siRNA 转染 NP 细胞。然后用 CoPP (10 μM) 或雷帕霉素 (500 nM) 预处理，再进行 FSS 处理。结果表明，CoPP 或雷帕霉素处理在很大程度上逆转了 IFT88 敲低诱导的 LC3-II/LC3-I 比值和 Beclin-1 蛋白水平的改变，自噬体和自噬酶体的形成，sGAG 含量及合成代谢和分解代谢 ECM 蛋白的表达。
实验结论
该研究结果表明，中等 FSS 可以维持 NP 细胞中的 ECM 稳态，这需要在初级纤毛存在下 HO-1 介导的自噬激活。
这项研究可以让我们更好地了解中等 FSS 介导的 NP 细胞 ECM 稳态的维持，并可能为IVD退行性变的早期预防和治疗提供新的策略。
参考文献：Chen S, Qin L, Wu X, Fu X, Lin S, Chen D, Xiao G, Shao Z, Cao H. Moderate Fluid Shear Stress Regulates Heme Oxygenase-1 Expression to Promote Autophagy and ECM Homeostasis in the Nucleus Pulposus Cells. Front Cell Dev Biol. 2020 Mar 3;8:127. doi: 10.3389/fcell.2020.00127. PMID: 32195253; PMCID: PMC7064043.
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