实验结果
实验将暴露于 0–20 dyn/cm2 生理 LSS 的悬浮细胞定义为模拟循环肿瘤细胞 (m-CTC),并在相关实验中将其用作 CTC 的替代品。
首先将 CRC 细胞系 LoVo 和 SW480 悬浮细胞加载到剪切应力装置中,检测 LSS 响应分子 ATOH8 的表达。在大小梯度 (0、5、10、20 dyn/cm2;30 min) 和时间梯度 (10 dyn/cm2;0、15、30、60 min) 剪切应力刺激后,免疫荧光分析、定量聚合酶链反应 (qPCR) 和蛋白质印迹 (WB) 结果同时显示,表明 ATOH8 在CRC m-CTCs 中的表达水平和核定位均升高(图1 a-f)。施加 LSS 15min后,CRC m-CTCs 中 ATOH8 的 mRNA 水平明显增加,并在 4 h 左右达到最大值。
为了进一步研究 ATOH8 在体内对 LSS 的反应,研究人员采集了外周血样本并进行 CTC 评估。数据表明 CRC CTC 中的 ATOH8 表达对LSS 敏感。总之,结果表明,LSS 可以触发 m-CTCs 中 ATOH8 的上调,这可能影响结直肠癌的血行转移和预后。
进一步的实验发现, ATOH8 分别有效地促进了细胞迁移和侵入能力。此外,在悬浮的 LoVo 和 SW480 细胞中,检测到抑制 ATOH8 对细胞凋亡的影响,而在 ATOH8 过表达组中细胞周期没有显著变化。上述数据表明 ATOH8 过表达可能通过抑制死亡而不是促进增殖来增加 CTCs 的数量。总之,体外和体内实验数据表明,通过表达ATOH8 的 m-CTCs 具有独特的抵抗死亡的能力,并在 CRC 转移中发挥重要作用。
接下来,实验证实了ATOH8 通过 HK2 介导的糖酵解促进 CRC m-CTCs 存活。此外,实验观察到 LSS 驱动的 ATOH8 的分子可塑性促进了 m-CTC 的存活。新出现的证据表明,细胞因子的分泌有助于 LSS 相关的机械转导。生物信息学分析表明,血管内皮生长因子(VEGF)是由 LSS 刺激的内皮细胞(GSE13712和GSE52211)分泌的。
因此,实验研究了 CRC 细胞中的细胞因子和细胞因子受体的水平,发现 LSS 显著上调了 VEGF。与 ATOH8 一致,通过 LSS 施加强度和持续时间的逐渐增加,在两种 CRC m-CTCs 中均观察到 VEGF 的上调和其分泌的增加。值得注意的是,以往文献表明,当人脱落的乳牙暴露于 4 dyn /cm2 的剪切应力约 4h 时,VEGF 分泌逐渐达到平台期,这与 CRC m-CTCs 中 ATOH8 mRNA 的变化趋势相似。
事实上,在 VEGF 处理的悬浮 CRC 细胞中,实验检测到较少的 ROS 积累和失巢凋亡。同时,VEGF 提高了 CRC m-CTCs 的细胞活力,无论是活细胞还是死细胞实验都可以看出。这些结果表明 CRC m-CTCs 的自分泌 VEGF 可能有助于 LSS 诱导的 ATOH8 上调和细胞存活的变化。随后,研究人员证实了该假设。
总之,这些发现表明 ATOH8 介导的促进 CRC m-CTC 存活的部分取决于 LSS 诱导的自分泌VEGF 信号。VEGF 通过与 CRC 细胞中的 VEGF 受体 2 (VEGFR2) 结合发挥作用,同样,目前的研究结果表明,VEGFR2在暴露于 LSS 的 CRC m-CTC s中上调。随后,实验证实, VEGFR2 相对负责 CRC 细胞中 VEGF 介导的ATOH8 上调。
AKT 和 ERK 信号通路都位于 VEGFR2 的下游,据报道它们与细胞存活有关。然而,目前尚不清楚 AKT 或 ERK 信号是否与 VEGF / VEGFR2 / ATOH8 轴诱导的 CTC 存活有关。最后,实验发现,VEGF 通过选择性激活 VEGFR2-AKT 信号来上调 ATOH8,这对于理解和靶向 m-CTC 存活的潜在机制具有重要意义。
实验结论
参考文献:Huang Q, Li S, Hu X, Sun M, Wu Q, Dai H, Tan Y, Sun F, Wang C, Rong X, Liao W, Peng J, Xiao J, Huang L, Wang J, Liang B, Lin K, Liu Y, Shi M. Shear stress activates ATOH8 via autocrine VEGF promoting glycolysis dependent-survival of colorectal cancer cells in the circulation. J Exp Clin Cancer Res. 2020 Jan 30;39(1):25. doi: 10.1186/s13046-020-1533-0. PMID: 32000836; PMCID: PMC6993408.
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