PD-1/PD-L1 轴对 hADMSCs 分化的成骨细胞的免疫调节作用和骨稳态调节

众所周知，人类间充质干细胞（hMSCs）在干细胞治疗中具有巨大的潜力，因为它们具有免疫抑制作用和多能性，使它们能够分化成不同的细胞类型，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经元细胞等。hMSCs 还分泌各种生物因子，包括与细胞内通讯相关的趋化因子、细胞外囊泡和生长因子。

程序性细胞死亡受体1（PD-1）配体1（PD-L1）是 hMSC 分泌的因子之一，在生理条件下有助于 T 细胞介导的免疫抑制。更好地理解 PD-1/PD-L1 轴的免疫抑制作用可能会为我们提供对那些处理免疫调节功能的领域特别有益的见解。研究表明，PD-L1 以细胞外形式存在，外泌体 PD-L1 主要由肿瘤细胞分泌，包括黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞，调节免疫反应。hMSCs 也可以分泌外泌体 PD-L1，但对干细胞研究中 PD-1/PD-L1 轴的了解仅限于其免疫抑制功能。

骨骼是一个复杂而动态的器官，不断被重塑，骨骼代谢通过组织中成骨细胞和破骨细胞的活性来平衡。成骨细胞从多能间充质细胞谱系分化而来，而破骨细胞则来自免疫细胞，例如单核细胞-巨噬细胞谱系。众所周知，PD-1/PD-L1 轴在破骨细胞的形成和活性中发挥作用，这反映在破骨细胞从免疫细胞分化的事实中。然而，PD-1/PD-L1 轴在成骨细胞中的作用及其对骨基质的调节作用还有待研究。

在这里，韩国东国大学生命科学系课题组的一项研究展示了 PD-1/PD-L1 轴对成骨细胞成骨特性的调节功能和免疫调节作用，以及它在成骨细胞和破骨细胞共培养系统中的再生、稳态维持作用。

PD-1 在源自 hADMSCs 的分化细胞中的表达

实验首先对分化细胞中PD-1的表达水平与hADMSCs中PD-1的表达水平进行比较，阐明了 PD-1 受体表达随着 hADMSCs 成骨分化而增加，实验结果表明，由于脂肪细胞和成骨细胞中受体的相互表达，PD-1 表达的增加可能对调节成骨特性很重要。

免疫抑制作用调控与 hADMSCs 共培养的分化细胞中促炎细胞因子的表达

研究表明，阻断 PD-L1 可促进巨噬细胞中 IL-6 和 TNF-α 的表达。然而，由促炎细胞因子与 hADMSCs 及其相邻细胞中的 PD-1/PD-L1 轴之间的串扰介导的免疫抑制作用尚不清楚。实验中建立了分化细胞和hADMSCs的共培养环境，并评估了促炎细胞因子的表达水平，以研究与hADMSCs的串扰介导的分化细胞的免疫抑制作用（图1）。

作为促炎细胞因子的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平在共培养和单培养脂肪细胞之间没有显著差异（图1 C、D）。然而，与单独培养的成骨细胞相比，与 hADMSCs 共培养的成骨细胞显示出促炎细胞因子表达水平降低，这反映了 hADMSCs 的免疫抑制潜力（图1 E-H）。与单一培养的成骨细胞相比，在与 hADMSCs 和 PD-L1 处理的成骨细胞共培养的细胞培养基中，分泌的促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-1β 水平降低。也就是说，hADMSCs 影响共培养的成骨细胞，从而通过可渗透膜的旁分泌作用调节免疫抑制作用。

图1 与hADMSCs共培养的分化细胞中促炎细胞因子的表达水平。

（A）分化的脂肪细胞与 hADMSCs 共培养。（B）TNF-α、（C）IL-1β和（D）IL-6的相对 mRNA 表达水平。（E）分化的成骨细胞与hADMSCs共培养。（F）TNF-α、（G）IL-1β和（H）IL-6的相对 mRNA 表达水平。

通过抑制与 hADMSCs 共培养的分化细胞中的 PD-1/PD-L1 轴来减弱促炎细胞因子的表达

为了检查 PD-1/PD-L1 轴是否参与共培养成骨细胞中促炎细胞因子表达的降低，BMS 202 抑制了 PD-1/PD-L1 的相互作用（图2）。即使在抑制 PD-1/PD-L1 相互作用的情况下，共培养的脂肪细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平仍然保持不变（图2 A-D）。然而，在抑制 PD-1/PD-L1 轴后，共培养的成骨细胞中促炎细胞因子降低的表达呈减弱趋势，之后共培养和单培养的成骨细胞之间没有显著差异（图2 E-H）。总之，实验假设在共培养的环境中，分化成骨细胞中 PD-1 的表达升高与 hADMSCs 分泌的 PD-L1 相互作用，从而在成骨细胞中引发免疫抑制反应。

图2 在与 hADMSCs 共培养的分化细胞中通过抑制 PD-1/PD-L1 轴减弱促炎细胞因子的表达。

（A）在与 hADMSCs 共培养的分化脂肪细胞中，PD-1/PD-L1 相互作用受到抑制。（B ）TNF-α、（C）IL-1β和（D）IL-6的相对 mRNA 表达水平。（E）PD-1/PD-L1 相互作用在与 hADMSCs 共培养的分化成骨细胞中受到抑制。（F）TNF-α、（G）IL-1β和（H）IL-6的相对 mRNA 表达水平。

PD-1/PD-L1 轴对与 hADMSCs 共培养的成骨细胞成骨特性的调节作用

最近的研究表明，促炎细胞因子网络参与成骨细胞分化和骨代谢过程，碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和 Runt 相关转录因子2（RUNX2）有助于成骨祖细胞的成骨分化，被认为是分化成骨细胞的标志蛋白。在这里，实验评估了单培养和共培养的成骨细胞和钙沉积物中的成骨标志物表达。

与单一培养的成骨细胞相比，共培养 3 或 7 天的成骨细胞均表现出成骨标志物（ALP、OCN、RUNX2）的表达升高，这有助于增强成骨特性。与单一培养的成骨细胞相比，在共培养中，作为骨矿化产物的钙沉积染色的相对量增加，并且在抑制 PD-1/PD-L1 相互作用后，增加的钙沉积减弱，之后与单一培养的成骨细胞无显著差异，这表明BMS 202处理的共培养成骨细胞的钙沉积染色减少。该结果表明，PD-1/PD-L1 轴不仅有助于成骨细胞的抗炎作用，而且还增强了由成骨细胞和 hADMSCs 之间的相互作用介导的成骨特性。

外泌体 PD-L1 对成骨细胞骨基质形成的影响

为了研究 PD-1/PD-L1 轴对成骨细胞骨基质形成的影响，用 PD-L1 和来自 hADMSCs 的外泌体处理成骨细胞。结果表明，与未处理的成骨细胞相比，PD-L1 和来自 hADMSCs 的外泌体的处理诱导了钙沉积的增加。在 PD-L1和外泌体处理下，1型胶原蛋白（COL1A1）（形成钙沉积所在的成骨细胞的细胞外基质）以及参与胶原蛋白沉积的 PDZ 和 LIM 结构域蛋白3（PDLIM3）的表达水平均显著增加。此外，RUNX2 的表达略有增加，它倾向于在成熟的成骨细胞中表达。PD-1/PD-L1 相互作用的抑制减少了 PD-L1 和外泌体处理的成骨细胞中钙沉积的增加以及 PDLIM3 和 RUNX2 的表达。这些结果表明，PD-L1 和来自 hADMSCs 的外泌体与成骨细胞中的 PD-1 相互作用，从而有助于增强骨基质形成和成骨特性。

PD-1/PD-L1 轴对共培养环境中骨稳态的调节作用

骨骼极其复杂，是一个动态器官，不断被成骨细胞和破骨细胞串扰重塑。实验建立了来自 hADMSCs 的成骨细胞和来自 THP-1 单核细胞的破骨细胞的共培养系统，并评估了 PD-1/PD-L1 轴对体外骨代谢系统的调节作用（图3）。有趣的是，在该共培养系统中，PD-L1 或 hADMSC 衍生的外泌体处理并未增强成骨细胞介导的骨基质中的钙沉积，这与上述结果不一致（图3 A-C）。然而，在共培养系统中，PD-L1 或外泌体处理后，与成骨细胞成骨特性相关的分子因子（如 COL1A1、PDLIM3 和 RUNX2）的表达水平增加（图3 D-G）。同样，与破骨细胞共培养的成骨细胞中，PD-L1 和外泌体处理也增加了成骨标志物（ALP、OCN、RUNX2）表达水平（图3 H-J）。PD-1/PD-L1相互作用的抑制不影响骨基质中的钙沉积，但在PD-L1/外泌体处理的成骨细胞中，直接形成骨基质的COL1A1的表达减弱（图4）。这些结果表明，与成骨细胞的单一培养环境不同，PD-1/PD-L1 轴有助于增加与成骨细胞成骨特性增加相关的因子的表达，并在体外骨代谢模型中维持成骨细胞和破骨细胞之间的平衡，在该模型中它介导了骨稳态。

图3 外泌体 PD-L1 对共培养环境中骨基质形成的调节作用。

（A）成骨细胞和破骨细胞共培养以模拟生理条件下的骨代谢。（B）PD-L1 和外泌体处理的共培养成骨细胞中骨稳态的维持。（C）染色的钙沉积物被溶解和量化。（D）PD-L1和外泌体在共培养成骨细胞中成骨特性调节蛋白的表达水平。（E）COL1A1、（F）PDLIM3 和（G）RUNX2的相对表达水平。成骨标志物（H）ALP、（I）OCN、（J）RUNX2的mRNA相对表达量。

图4 通过抑制 PD-1/PD-L1 相互作用减弱共培养成骨细胞的成骨特性。

（A）PD-1/PD-L1 相互作用在共培养环境中受到抑制。（B）维持共培养的成骨细胞中的骨矿化。（C）染色的钙沉积物被溶解和量化。（D）抑制 PD-1/PD-L1 相互作用后介导成骨特性的蛋白质表达水平减弱。（E）COL1A1、（F）PDLIM3 和（G）RUNX2的相对表达水平。

在这项研究中，展示了 PD-1/PD-L1 轴如何调节从 hADMSCs 分化的成骨细胞的免疫抑制作用和骨稳态，发现 PD-1/PD-L1 轴仅在没有破骨细胞的单一培养环境中有助于增强骨矿化，共培养系统表明，影响成骨细胞和破骨细胞的 PD-1/PD-L1 轴有助于维持骨稳态。这些数据提供了关于 PD-1/PD-L1 轴的新见解，可用作干细胞治疗中预防骨疾病的治疗靶点，从而阐明干细胞中仍然存在的一些挑战细胞疗法。

参考文献：Lee SC, Shin MK, Jang BY, Lee SH, Kim M, Sung JS. Immunomodulatory Effect and Bone Homeostasis Regulation in Osteoblasts Differentiated from hADMSCs via the PD-1/PD-L1 Axis. Cells. 2022 Oct 7;11(19):3152. doi: 10.3390/cells11193152. PMID: 36231113; PMCID: PMC9564087.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36231113/

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