剪切应力增强小鼠诱导多能干细胞的成骨分化

由于其成骨诱导的特性，基于干细胞的骨再生疗法有望改善临床中的骨愈合。诱导多能干细胞（iPSCs）具有无限的增殖能力，可以作为体外组织工程的干细胞库。此外，iPSCs具有多能性和自组织潜力，可以分化成三个胚层（内胚层、中胚层、外胚层），并且可以在不使用支架的情况下形成三维（3D）组织或器官。因此，iPSCs可能是骨组织工程的一个有希望的来源。但iPSCs的成骨分化需要更大的刺激来引导足够的iPSC分化为成骨细胞。

机械刺激，特别是那些来自剪切力、压缩力和拉伸力的刺激，在胚胎发生/器官发生过程中发挥作用。先前的研究表明，剪切应力以不同的方式增强了间充质基质细胞、成骨细胞和骨细胞的成骨分化，这取决于施加的剪切力的大小、持续时间和频率。然而，对这种现象背后的机制知之甚少。

类器官技术的最新趋势，以及再生医学骨组织工程的趋势，依赖于iPSC自组织，这仍然需要一个强大的成骨分化因素。剪切力已被广泛研究用于干细胞/骨细胞的成骨分化。尽管剪切应力对改善骨组织工程很有吸引力，但其对iPSCs成骨分化的影响尚不清楚。

因此，日本东北大学牙科研究生院、泰国朱拉隆功大学牙科学院等研究团队假设特定的剪切应力可以增强小鼠iPSC成骨分化。为了验证这一假设，使用剪切应力加载装置在成骨诱导下将剪切应力施加到附着型胚状体（EB）培养物上，使细胞承受连续的剪切力。

连续剪切应力对小鼠iPSC活力、增殖和多能性的影响

小鼠牙龈来源的 iPSCs进行成骨诱导，用三种不同程度的剪切应力（0.15、0.5和1.5 Pa）应用于粘附的iPSCs。

结果发现，测试的幅度没有明显影响细胞活力。1天后，与生长培养基（ES培养基）相比，细胞增殖显著减少。将细胞在静态条件下再维持两天后，成骨诱导培养基中的细胞数明显低于ES培养基中的细胞数。第3天，在剪切应力（0.15、0.5和1.5 Pa）下，细胞数显著低于静态组，且呈力依赖性下降。施加剪切应力2 天后，Oct3/4、Sox2和Nanog的基因表达略有增加，而Klf4表达以力依赖性方式略有下降。剪切应力加载组中Nanog和Oct4的蛋白表达增加。0.5和1.5 Pa剪切力加载组的Klf4蛋白表达量下降，而在0.15 Pa的剪切应力加载下，Klf4表达量略有增加。

连续剪切应力对小鼠iPSCs成骨分化的影响

实验探讨了不同剪切力大小对成骨表达的影响。实时荧光定量PCR分析显示，在剪切应力作用下，osterix蛋白（Osx）、骨钙素（Ocn）和骨桥蛋白（Opn）均显著上调。OCN表达在0.5 Pa组中最高（图1 A）。相对于静态组，胶原蛋白1a1（Col1a1）表达仅在0.5 Pa组中显著增加。与静态组相比，Runx2的表达水平在0.15和1.5 Pa组中受到抑制，但在0.5 Pa组中未被抑制（图1 A）。成骨相关蛋白Osx、Col1a1和Opn在剪切应力应用组中的表达高于静态组（图1 B）。在所有组的EB区均观察到阳性茜素红S（ARS）染色（图1 C）。相反，在剪切应力加载组中观察到细胞生长区域的阳性染色（图1 C）。ARS染色的定量显示，相对于静态组，矿化度显著增加，在0.5 Pa组中观察到最高的矿化度（图1 D）。

图1 连续剪切应力以与力无关的方式增强了iPSCs的成骨分化

剪切应力持续时间对小鼠iPSCs成骨分化的影响

在施加剪切应力24 h后，Osx和Ocn上调（图2 A）。暴露48小时后，Osx表达相对于静态组的倍数变化进一步增加。在剪切应力12 h后，Col1a1和Opn显著上调，后者在24 h和48 h分别进一步增加到3倍和7倍，而Col1a1表达的倍数变化在所有时间点都保持在2–2.5倍（图2 A）。静态组在12和24小时未发现阳性染色。相反，在0.5 Pa组的生长细胞区域中观察到阳性ARS染色（图2 B）。ARS定量显示，48 h内0.5 Pa组的矿物沉积量明显高于静态组（图2 C）。在施加剪切应力（0.5 Pa）48 h后，Osx的表达和核定位增强（图2 D、E）。相对于静态组，Opn蛋白在0.5 Pa组中的表达更高（图2 F、G）。

图2 连续剪切应力以时间依赖性方式增强了iPSCs的成骨分化

评估0.5Pa下的成骨分化；在施加0.5 Pa剪切应力12、24和48小时之前，iPSCs在OS培养基中维持1天，在同一时间点收集OS培养基中的对照静态培养物进行评估。

连接蛋白43（Cx43）和Trpm7参与剪切应力诱导的小鼠iPSCs成骨分化

研究表明，剪切应力通过p38和Erk1/2通路调控细胞表面通道Trpm7和Cx43，增强了小鼠间充质干细胞和人PDLCs的成骨分化。施加剪切应力2天后，与静态组相比，0.15、0.5和1.5 Pa剪切应力组中Tprm7、Cx43、磷酸化-Erk1/2和磷酸化-p38蛋白的表达增强（图3 A）。此外，在0.5 Pa组中观察到最高的Cx43表达（图3 A）。蛋白质印迹分析显示，0.5 Pa组中的Cx43和磷酸化-Erk1/2表达显著更高（图3 B）。在静态组中观察到细胞核周围的Cx43表达，而在细胞膜周围观察到0.5 Pa组中的Cx43表达更高（图3 C、E）。剪切应力（0.5 Pa）增强了细胞细胞质中Erk1/2的磷酸化（图3 D、E）。静态组中的Trpm7表达主要在细胞核周围检测到，而0.5 Pa组中在整个细胞中观察到Trpm7通道表达（图3 F）。

图3 连续剪切应力增强iPSCs成骨分化的机制。在承受剪切应力48小时后分析iPSCs

Erk1/2信号通路参与剪切应力诱导的小鼠iPSCs成骨分化

细胞毒性测定显示，用1μM和10μM SCH772984（一种Erk1/2磷酸化抑制剂）处理没有显著差异。较高的浓度（20、30、40 和 50 μM）导致细胞活力显著降低（图4 A）。在静态和0.5 Pa组中以及用1 μM和10 μM SCH772984处理组中观察到细胞形态不均匀（图4 B）。在静态培养组中，用1μM SCH772984处理24小时不影响成骨标志基因（Osx和Ocn）表达。然而，用10μM SCH772984处理后，只有Osx基因表达显著降低。相反，在施加剪切应力（0.5 Pa）24 h后，Osx、Ocn和Opn上调。此外，抑制剂处理组的上调受到显著抑制（图4 C）。在施加剪切应力一天后，在ARS染色之前将细胞在静态条件下再维持5天。在剪切应力组的生长单元区域观察到增强的矿物沉积（图4 D）。用10μM SCH772984处理可抑制剪切应力施加过程中的矿物沉积。茜素红S的定量分析显示，与静态组相比，剪切应力应用组的矿物沉积显著增强（图4 E）。抑制剂处理组和静态处理组之间未观察到显著差异。

图4 抑制Erk1/2活性抑制了剪切应力增强的iPSCs的成骨分化

图5 剪切应力增强小鼠iPSCs成骨分化及相关机制示意图

剪切应力通过连接蛋白43（Cx43）和Erk1/2信号通路增强小鼠iPSCs的成骨分化。Erk1/2活性的抑制部分抑制了成骨基因的表达。Trpm7表达和下游磷酸化-p38在剪切应力下上调，这意味着它们可能参与了剪切应力增强iPSCs的成骨分化。

总之，该研究发现剪切应力增强了小鼠iPSCs的成骨分化，部分是通过Cx43和下游Erk1 / 2信号通路。此外，0.5 Pa将是诱导小鼠iPSC向成骨细胞分化的最佳剪切力大小。

参考文献：Limraksasin P, Nattasit P, Manokawinchoke J, Tiskratok W, Vinaikosol N, Okawa H, Limjeerajarus CN, Limjeerajarus N, Pavasant P, Osathanon T, Egusa H. Application of shear stress for enhanced osteogenic differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2022 Nov 8;12(1):19021. doi: 10.1038/s41598-022-21479-8. PMID: 36347883.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36347883/

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