精调 Piezo1 表达和活性可确保骨骼肌肌发生过程中高效的成肌细胞融合

骨骼肌是人体中最大的肌肉组织，由有丝分裂后的多核肌纤维构成。肌肉干细胞，也被称为卫星细胞（SCs），是骨骼肌中位于肌纤维和基膜之间，当受到外界刺激导致肌细胞损伤时，它们被激活形成成肌细胞，并具有增殖和分化能力，能够修复受损的肌纤维，并与原有的肌细胞进行融合重建肌肉纤维，骨骼肌得到再生。因此，成肌细胞融合机制的改变会对再生效率和整体肌肉功能和健康产生深远的影响。决定成肌细胞融合的一个重要过程是机械感受，但这如何在肌肉中调节仍然在很大程度上是未知的。

机械敏感性（MS）离子通道是指一类感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道。Piezo1和Piezo2首先被确定为哺乳动物细胞中的力传感器。Piezo1是机械敏感性的非选择性阳离子通道，对Na+、K+、Ca2+ 和 Mg2+ 全部渗透，但更偏向Ca2+。Ca2+ 调节在骨骼肌的保持和修复中起着至关重要的作用，因此，在开发肌营养不良症（肌肉萎缩症）的治疗干预措施时，了解Piezo1的功能可能至关重要。

在日本丰桥创造大学健康科学学院、英国伦敦国王学院兰德尔细胞和分子生物物理中心等团队的一项研究中，分析了Piezo1在骨骼肌肌发生中的作用，重点关注肌肉分化及其在拉伸诱导的原代成肌细胞来源的肌管 Ca2+ 内流中的作用。研究成果发表在 Cells 期刊题为“Fine-Tuning of Piezo1 Expression and Activity Ensures Efficient Myoblast Fusion during Skeletal Myogenesis”。

首先，为了研究Piezo1在肌源性进展过程中的表达水平，利用小鼠快趾长伸肌（EDL）和慢比目鱼肌（SOL）肌肉卫星细胞（SC）来源的原代成肌细胞（图1 a）。在SOL来源的成肌细胞中，Piezo1表达在24小时后迅速增加，表明Piezo1在慢肌肉发生中的早期功能。与EDL来源的成肌细胞相比，Piezo1在SOL来源的成肌细胞中在24小时和72小时的分化上调（图1 b）。因此，Piezo1表达在成肌细胞分化期间增加。然而，在蛋白质水平上发现EDL和SOL来源的肌管在同一水平上调Piezo1（图1 c-e）。这可能是由于这些肌肉群之间的转录和翻译差异。这些结果要求进一步研究Piezo1在EDL和SOL来源细胞中的积极作用。

Ca2+ 本身是肌肉收缩的关键调节因子，也是肌肉形成和分化/融合过程中早期的重要调控。因此，鉴于Piezo1 mRNA在分化成肌细胞中的积累，实验试图评估Ca2+ 内流（[Ca2+]i）的动力学在培养的肌管中对Piezo1活性的调节，将样本分为两组：给予Piezo1特异性siRNA（Piezo1-敲低）和给予Piezo1激动剂Yoda1（30μM），给药前施加渐进拉伸，在最初的1分钟休息时间（0%拉伸）后，拉伸量分别为3% 、6% 和9%，持续1分钟，然后休息1分钟。

在对照条件下（siRNA对照和无Yoda1），在机械拉伸时，[Ca2+]i 在EDL来源和SOL来源的肌管中与无拉伸（0%）对照组相比显著增加。EDL来源的对照肌管，拉伸力超过3% 时显示 [Ca2+]i 的显著增加。与对照细胞（siRNA对照）相比，在 [Ca2+]i 响应拉伸后Piezo1的减少被强烈抑制。[Ca2+]i 在EDL来源的肌管中被完全消除，6% 和9% 的拉伸都不会引起其显著增加。同样，在所有拉伸组中，SOL来源的肌管中Piezo1的减少显示出 [Ca2+]i 的显著降低，只有Piezo1敲低的肌管在 9% 的拉伸条件下显示出 [Ca2+]i 的增加。因此，Piezo1对拉伸期间 Ca2+ 内流至关重要。

Yoda1介导的Piezo1激活能够降低其激活阈值。实验发现，在拉伸（0%拉伸）之前，Yoda1施用的肌管已经开始显示出增强的 [Ca2+]i，3% 拉伸时，[Ca2+]i 显著升高，这种 [Ca2+]i 的增加在高拉伸时持续存在。总之，Piezo1的表达和活性对肌肉功能中的Ca2+调节至关重要。

图1 Piezo1表达在分化的SC来源的成肌细胞中增加。

Piezo1 表达在后期肌生成阶段中达到峰值，它调节收缩期间的钙内流。然而，Piezo1 是否参与肌生成的早期阶段尚不清楚。因此，评估了Piezo1 对增殖和肌生成开始的影响，发现Piezo1的敲低对EDL和SOL来源的成肌细胞的增殖速率没有明显影响，因此Piezo1对于肌肉细胞增殖是可有可无的。接下来，通过分析转录因子Myogenin （肌细胞生成素）的积累，研究了 Piezo1 的减少是否可以改变分化阶段的入口。EDL来源或SOL来源的成肌细胞均未在Piezo1敲低和对照siRNA处理条件下显示Myogenin -阳性细胞相对比例上的显著差异，表明Piezo1不参与成肌细胞分化的发生。

成肌细胞融合需要广泛的膜重塑和机械应力，因此，评估了Piezo1抑制对肌管形成和成熟的影响。Piezo1的敲低导致成肌细胞融合的显著减少，随后阻碍了EDL和SOL来源的肌管的形成。EDL 和 SOL 来源的成肌细胞显示融合蛋白Myomaker的表达降低，表明融合机制在分子水平上发生了改变。另一方面，Myomixer 蛋白的表达呈下降趋势。此外，早期形成的肌管中Piezo1的敲低证实了融合指数的显著降低。总之，Piezo1表达的失调降低了细胞融合到新的或现有的肌管中的能力。

Piezo1的敲低可减少成肌细胞融合并改变 Ca2+ 内流。接下来，实验评估了Piezo1激活的剂量依赖性效应，对早期形成的肌管在一段时间内经受不同浓度的Yoda1（图2）。Yoda1 的1分钟处理显著增强了细胞融合（图2 a-d），然而，用最高剂量（100 μM）的Yoda1进行30分钟的处理具有相反的效果，降低了融合指数，这表明必须精细调控Piezo1活性以实现有效的融合和肌管成熟。在孵育30分钟时，EDL和SOL来源的肌管在30 μM Yoda1 下均显示融合增加（图2 b、d）。孵育 1 小时后，EDL和SOL来源的肌管在5、10 和30 μM Yoda1 处理下表现出更高的融合效率（图2 b、d）。

在分子水平上，Yoda1给药后EDL和SOL来源的肌管中的Piezo1表达增加。Myomaker表达在EDL和SOL来源的肌管中也与Piezo1上调平行，而Myomixer呈现无统计意义的增加。总之，数据表明，Piezo1活性的精细调控是分化动力学的关键步骤。

实验注意到，诱导激活Piezo1似乎会影响肌管的大小，尽管增加了成肌细胞融合。为了解决这个问题，将这些样本的肌管宽度（直径）与DMSO对照比较。有趣的是，EDL和SOL来源的肌管与Yoda1处理时均显示肌管宽度减小。综上所述，Piezo1的过度激活使成肌细胞融合和肌管生长不平衡。

图2 Piezo1 活化以肌管合胞体成熟为代价增加成肌细胞融合。

随着成肌细胞融合，成肌分化需要广泛的细胞重塑，先前的研究将Piezo1调节在细胞骨架稳态中起关键作用。最后，为了了解 Piezo1 是否有助于调节细胞骨架结构，包括 F-肌动蛋白，实验评估了 EDL 和 SOL 来源的肌管中成肌分化期间细胞骨架重组的程度。Piezo1敲低显示F-肌动蛋白的积累显著减少，表明Piezo1的降低会改变细胞骨架动力学。相比之下，F-肌动蛋白积累不受Piezo1过度激活的影响，这表明Piezo1可能不直接促进F-肌动蛋白重塑。与成肌细胞融合的改变一致，过度Piezo1的化学激活显示EDL和SOL来源的肌管中的F-肌动蛋白显著降低。这些发现表明，Piezo1表达和/或其激活状态的失调会影响成肌细胞融合和肌肉分化过程中的细胞骨架组织。

总之，该研究中提供的数据表明，Piezo1通道存在于SC来源的成肌细胞和肌管中，但在后者中表达的比例更高。Piezo1的下调显著降低了肌管形成、生长和成熟过程中的融合能力。相比之下，Piezo1活化增加了融合。未来研究肌管功能（完整性、Ca2+内流、细胞骨架组织和融合）的变化是机械应力的直接结果，应该考虑对Piezo1的分析。在针对DMD等肌肉萎缩症的治疗策略的背景下，我们不仅必须解开Piezo1表达的时空调控，而且必须意识到该通道改变其Ca2+ 内流阈值的能力。从药学上讲，像 Yoda1 这样的小激活分子可能是有益的。然而，在考虑这些激动剂作为可行药物之前，必须注意这些激动剂在体内的半衰期和药代动力学。Piezo1在骨骼肌维护和功能方面的重要性无疑将随着新的研究而增长。此外，鉴于Piezo1在肌源性进展中的关键作用及其在卫星细胞中的表达，Piezo1活性的改变可能与卫星细胞病的发病机制有关。

参考文献：Ortuste Quiroga HP, Ganassi M, Yokoyama S, Nakamura K, Yamashita T, Raimbach D, Hagiwara A, Harrington O, Breach-Teji J, Asakura A, Suzuki Y, Tominaga M, Zammit PS, Goto K. Fine-Tuning of Piezo1 Expression and Activity Ensures Efficient Myoblast Fusion during Skeletal Myogenesis. Cells. 2022 Jan 24;11(3):393. doi: 10.3390/cells11030393. PMID: 35159201; PMCID: PMC8834081.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35159201/

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