衰老肌肉干细胞的生长速率降低与机械敏感性受损有关

肌肉减少症是指随着年龄增长而发生的肌肉质量减少、骨骼肌流失和肌肉功能强度下降等，这是人体衰老的重要标志。影响肌肉质量和功能的原因有很多，但都是基于这两个基础机制：肌肉纤维萎缩和肌肉纤维丢失。这种肌肉纤维丢失归因于老化肌肉和相关肌肉干细胞（MuSC）的再生能力受损。

已经提出了几种导致MuSC功能受损的机制，特别是MuSC生态位的改变和细胞内在变化。其生态位中的MuSCs固定在宿主肌纤维的肌膜上，即在其基底侧通过钙粘蛋白，在其顶端侧通过整合素、蛋白聚糖和肌营养不良蛋白聚糖固定在基底膜。在肌纤维拉伸-缩短后，由于细胞外基质（ECM，即肌内膜）的拉伸和剪切变形，MuSCs承受机械载荷。这些变形也会导致肌肉内的间质液运动。目前尚不清楚MuSCs是否可以感知这些流体运动。

YAP核易位和转录活性是否在衰老MuSCs中失调尚不清楚，但YAP核化/活性可能是MuSCs中机械传感能力改变的指标。衰老MuSCs的机械敏感性受损的后果可能是广泛的，因为机械线索始终存在，无论它们来自肌肉活动还是生态位条件，并且对细胞功能具有最重要的影响。例如，细胞对基质刚度的感应会影响干细胞的粘附、形态、自我更新和命运决定。在衰老的MuSCs中，粘附、形态、黏着斑、YAP核化/活性和增殖是否发生内在改变尚未得到研究，但如果衰老的MuSCs的机械传感能力恶化，这些参数也必然会受到影响。

去年，阿姆斯特丹牙科学术中心、比利时鲁汶大学神经科学研究所、法国索邦大学等联合团队的一项研究曾旨在阐明衰老的MuSCs在感知和响应机械线索的能力方面是否受到内在损害。相关研究成果发表在 Aging 题为“Reduced growth rate of aged muscle stem cells is associated with impaired mechanosensitivity”。

增殖减少可能是骨骼肌再生能力随年龄增长而下降的限制因素。首先，研究发现尽管YAP核定位很高，但与年轻的MuSCs相比，衰老的MuSCs在体外的生长速率显著降低。衰老与MuSCs基因表达谱的改变有关。升高的细胞周期抑制剂CDKN2A（P16）是衰老细胞中的细胞标志物，其表达在衰老的MuSCs中被证明增加。实验发现，与年轻MuSCs相比，衰老的MuSCs表现出较低的Pax7、Ccnd1、Cdk4基因表达和较高的Myog表达，而Cdkn2a在衰老的MuSCs中的表达略高但并不显著。此外，衰老的MuSCs中的IL-6基因表达较低，这表明衰老的MuSCs在控制增殖和MuSC功能的信号通路中发生了内在改变。即目前的研究支持这样一种观点，除了细胞外因素外，MuSCs的一些内在变化会导致MuSC生长速率降低和功能改变，接下来的研究将讨论衰老的MuSCs的这些内在变化。

细胞的物理性质，包括面积、顶点高度、形状、核体积和细胞体积均受到严格调控，并受到各种刺激的影响，例如底物刚度、渗透压变化、剪切应力等机械扰动和生化信号。这些细胞参数的变化会影响干细胞功能和命运。因此，实验研究了衰老MuSCs的生长速率降低是否也伴随着细胞形态特性的改变。结果发现（图1），与年轻的MuSCs相比，衰老的MuSCs的细胞体积增加。细胞体积的增加对MuSCs的机械性能和机械敏感性有影响。此外，研究确定了衰老的MuSCs体积增加是否伴随着粘附数的减少，结果表明，衰老的MuSCs体积的增加可能至少部分是焦点粘连（focal adhesion）的组装和/或细胞骨架改变的结果。这可能会影响衰老的MuSCs生态位内的机械性能和机械敏感性。

图1 老化MuSCs表现出比年轻MuSCs更大的细胞体积。
（A）培养 3 天的年轻和老化 MuSCs 的俯视图（XY）和横截面图像（XZ，白色虚线），并染色 F-肌动蛋白丝（绿色）和细胞核（红色）以量化细胞形态测量。（B、C）MuSCs在基质胶涂层玻璃基板上的细胞扩散面积和细胞顶点高度。（D、E）老化MuSCs表现出比年轻MuSC大18%的细胞体积，而核体积没有差异。（F-H）年轻和老化MuSC之间的细胞形状描述符没有差异。（I-N）年轻和老化MuSCs的细胞顶点高度，细胞体积和细胞面积之间的相关性。

NO是一种重要的信号分子，通过激活基质金属蛋白酶并从ECM释放肝细胞生长因子，参与肌肉再生过程中MuSCs的激活。先前已经证明，脉动剪切应力（PFSS）诱导的C2C12（小鼠成肌细胞）肌管中NO生成需要完整的糖萼，并且糖萼的去除会消除PFSS对NO产生的影响。研究发现，年轻和老化的MuSCs对PFSS的反应相似，NO产生增强（图2）。抑制NO是否会导致年轻和衰老的MuSCs活性的差异目前尚不清楚。

造血干细胞与其细胞生态位的粘附性降低会对干细胞数量和功能产生负面影响。在目前的研究中，与年轻的MuSCs相比，老化的MuSCs与基质胶涂层玻璃基板的附着力较低，而由于PFSS应用，大量MuSC脱附。衰老的MuSCs中焦点粘连减少和ITGA7表达降低可能解释了细胞对基质胶涂层玻璃基板的粘附减少。此外，衰老的MuSCs中Ptk2基因表达的降低与细胞粘附的减少一致。细胞-基质粘附在多能干细胞的增殖和形态中起作用。实验得出的结论是，衰老MuSCs的生长速率降低至少部分是由于细胞粘附减少。

图2 PFSS诱导的NO产生和MuSC脱附。（A）PFSS诱导年轻和老化MuSC产生NO。PFSS效果显著，与静态对照差异显著。（B）透明质酸（糖萼成分，绿色）和细胞核（蓝色）染色的MuSC。俯视图（XY）和横截面图像（XZ，白色虚线）显示年轻和老化MuSCs表达糖萼（白色箭头）。（C）培养第一天和第三天年轻和老化MuSC中的糖萼表达。（D）PFSS处理前后MuSCs的显微照片显示老化MuSCs的数量下降。（E）在1小时PFSS期间（4.13 Pa/s），43%的老化MuSC从基质胶涂层的载玻片上脱附。

整合素的细胞质结构域与许多衔接蛋白（即PTK2和paxillin）相连，它们参与肌动蛋白细胞骨架组织、粘附、迁移、增殖、调节细胞形状以及将生化和机械信号传递到细胞中。在目前的研究中显示，衰老的MuSCs中Ptk2基因表达下降，pPXN簇数量减少，这表明衰老的MuSCs的生长速率降低和机械敏感性丧失至少部分是由于黏着斑形成和/或周转减少。此外发现，在衰老的MuSCs中，Itga7基因表达和ITGA7蛋白表达均降低，Itga5和Itgb5基因表达也下降。这表明ITGA7表达降低和黏着斑形成与随着年龄增长而改变的MuSC功能有关，可能是由于生态位变化导致MuSCs的内在变化。ITGA7和pPXN是改善衰老MuSC功能的潜在治疗靶点。

在机械传感中，hippo 通路及其效应子YAP和转录调节蛋白1（TAZ）是转录辅助因子，通过穿梭到细胞核中并通过与转录因子结合诱导基因表达的上调而发挥重要作用。它们决定MuSC的命运并影响肌肉再生。因此实验研究了在年轻和老化的静态对照和PFSS处理的MuSCs中YAP核定位。结果发现，老化静态对照和PFSS处理的MuSCs的总YAP比年轻MuSCs高5.3%，与静态对照相比，PFSS处理的年轻的MuSC在YAP强度方面呈上升趋势。此外，还确定了YAP核定位，老化MuSC表现出比年轻MuSC高59%的核YAP荧光强度。PFSS对MuSCs核内的YAP含量没有显著变化，但在年轻的MuSCs中，PFSS处理后的YAP核化略有增加。间充质干细胞中的YAP核化取决于细胞附着面积，与焦点粘连的组装无关。结果发现，附着面积较小的年轻和老化MuSC都表现出更高的YAP核化。

最后，研究发现，受剪切力作用的年轻MuSC上调了参与调节粘附，细胞周期和MuSC功能的基因的表达（图3）。老化的MuSCs对剪切力不太敏感，并且表现出较少的基因上调，这表明机械敏感性降低是由于整合素蛋白表达（即ITGA7，ITGA5和ITGB5）和焦点粘附数减少。此外，实验观察到在相似、明确的培养条件下，年轻和衰老的MuSCs之间的机械反应性存在差异。这表明，衰老的MuSCs在体外的机械反应性降低可能是由于衰老相关的细胞内在改变。未来的研究应致力于体内验证。研究还发现，剪切力会导致年轻和老化的MuSC变形。有趣的是，老化的MuSCs在剪切力下仍然变形，而年轻的MuSCs恢复了其最初的细胞顶点高度。此外，衰老的MuSCs显示出更高的细胞硬度变化，如力诱导的细胞压痕所示，这表明衰老的MuSCs具有改变的细胞骨架。

图3 老化MuSC对PFSS的机械敏感性减弱。（A）响应PFSS的MuSC基因表达。（B）在流体剪切应力处理之前（静态）和期间染色的年轻和老化 MuSC 的共聚焦俯视图 （XY） 和横截面 （XZ） 活细胞图像，用于 F-肌动蛋白丝（红色）和细胞核（绿色），说明由于流体剪切应力而导致细胞顶点高度的变化。（C、D）在CFSS处理开始时，CFSS诱导MuSC变形并降低年轻和老化MuSCs的细胞顶点高度。（E）年轻和老化的MuSCs具有相似的杨氏模量（~450Pa）。与年轻MuSC（27%）相比，老化MuSCs（61%）的变异系数较大。（F）力压痕曲线显示，与年轻的 MuSC 相比，压痕老化 MuSC 所需的力变化很大。（G）纳米压痕之前和期间染色 F-肌动蛋白丝（红色）和细胞核（绿色）的年轻 MuSC 的共聚焦横截面显微照片，说明细胞变形（虚线）。

在这项研究中，发现衰老的MuSCs的生长速率受到了内在的损害。由于ITGA7表达降低和粘附形成减少，细胞外部环境和细胞内部之间的机械联系受到年龄的显著影响，这与细胞体积增加，MuSC粘附降低以及细胞对机械负荷的机械敏感性改变相吻合。此外，YAP信号在衰老的MuSCs中发生了改变，包括细胞周期基因在内的几个基因的表达降低。作为一种暗示，一种可能的治疗选择可能是恢复衰老的MuSCs中的ITGA7和粘附数，这可能有助于恢复MuSCs粘附到其生态位以及这些细胞的生长速度。

参考文献：Haroon M, Boers HE, Bakker AD, Bloks NGC, Hoogaars WMH, Giordani L, Musters RJP, Deldicque L, Koppo K, Le Grand F, Klein-Nulend J, Jaspers RT. Reduced growth rate of aged muscle stem cells is associated with impaired mechanosensitivity. Aging (Albany NY). 2022 Jan 13;14(1):28-53. doi: 10.18632/aging.203830. Epub 2022 Jan 13. PMID: 35023852; PMCID: PMC8791224.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35023852/

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。如有任何的想法以及建议，欢迎联系小编。感谢各位的浏览以及关注！
微信搜索公众号“Naturethink”，了解更多细胞体外仿生培养技术及应用。