内皮 PHACTR1 通过抑制小鼠血流紊乱下的 PPARγ 活性来促进内皮细胞活化和动脉粥样硬化

内皮 PHACTR1 通过抑制小鼠血流紊乱下的 PPARγ 活性来促进内皮细胞活化和动脉粥样硬化

由动脉粥样硬化引起的冠状动脉疾病(CAD)是世界范围内导致死亡的主要原因。动脉粥样硬化斑块优先在血流紊乱(DF)区域形成,如动脉分叉处,其中 DF 引起内皮活化。磷酸酶和肌动蛋白调节因子1(PHACTR1)是高度保守的磷酸酶和肌动蛋白调节因子家族的成员之一,GWAS 研究表明,PHACTR1 位点的 SNP(单核苷酸多态性)与人类 CAD 和心肌梗死的发病、进展和结局显著相关。最近,有研究报道了 Phactr1-缺失的骨髓在体内加重了动脉粥样硬化。机制研究表明,巨噬细胞 PHACTR1 参与胞葬作用和巨噬细胞分化,抑制动脉粥样硬化。

基于此,在同济大学附属第十人民医院心血管内科、美国罗切斯特大学医学和牙科学院Aab心血管研究所等科研团队的一项研究中,使用全身和 EC-特异性 Phactr1 KO 小鼠来确定 PHACTR1 在体内动脉粥样硬化中的作用。PHACTR1 在小鼠 ECs 中表达丰富,研究结果表明,在载脂蛋白E-KO(Apoe−/−)小鼠中,全身或内皮特异性 Phactr1 的敲除显著减弱了高脂肪、高胆固醇(HF-HC)饮食诱导的动脉粥样硬化,特别是在 DF 区域。机制研究显示,内皮细胞 PHACTR1 位于 DF 下的细胞核中,通过抑制 PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的转录活性来促进 EC 的活化。具体研究成果发表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊题为“Endothelial PHACTR1 Promotes Endothelial Activation and Atherosclerosis by Repressing PPARγ Activity Under Disturbed Flow in Mice”。

内皮 PHACTR1 通过抑制小鼠血流紊乱下的 PPARγ 活性来促进内皮细胞活化和动脉粥样硬化

首先,实验建立了 PHACTR1 全身和条件敲除小鼠,为了确定 Phactr1 对动脉粥样硬化的影响,又杂交建立了 Phactr1−/−Apoe−/− 小鼠,并将实验组与对照组小鼠喂食 HF-HC 饮食诱导动脉粥样硬化。令人惊讶的是,敲除 Phactr1 显著减轻了 Apoe−/− 小鼠的动脉粥样硬化(图1 G、L),主动脉窦、主动脉弓内粥样硬化斑块面积减少(图1 G、H),但胸/腹主动脉的动脉粥样硬化病变面积与对照组小鼠相似(图1 I、L)。这表明,PHACTR1 是动脉粥样硬化发展所必需的。

然后,科研人员使用 GTEx 数据库进行搜索,发现 4 个 PHACTR1 SNPs(rs12526453、rs9349379、rs9369640、rs4714955)与 PHACTR1 mRNA 表达相关,并且在分析的49个组织中,这种关联主要存在于非病变动脉(包括胫动脉、主动脉和冠状动脉)中,而不在神经系统、免疫系统或其他组织中,这提示血管 PHACTR1 在动脉粥样硬化中的作用。PHACTR1 蛋白检测显示,其在脑和肺中高表达,而在心脏、肝脏、脾脏、结肠和脂肪组织中没有检测到。此外,还观察到 PHACTR1 在主动脉中表达,特别是在主动脉内膜(主要是ECs)中表达,但在中膜(主要是VSMCs)和外膜中不表达。这些数据暗示了内皮细胞 PHACTR1 在动脉粥样硬化进展中的潜在作用。

为了具体研究内皮 PHACTR1 在动脉粥样硬化中的作用,建立了 EC特异性 Phactr1 KO(Phactr1ECKO),在与Apoe−/−小鼠杂交后,生成Phactr1ECKOApoe−/− 和Phactr1f/fApoe−/− 对照小鼠,并用 HF-HC 喂养。与上述结果一致,Phactr1ECKOApoe−/−小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积减少。EC特异性 Phactr1 KO 可显著减轻主动脉弓区域的动脉粥样硬化,但对胸/腹主动脉没有作用。主动脉弓区域的血流紊乱促进了动脉粥样硬化斑块的形成,研究结果表明,内皮细胞 PHACTR1 可能介导了这一过程。然后对部分颈动脉进行结扎,触发 LCA 的振荡流,结果表明,EC特异性 Phactr1 KO 可显著减弱 DF 相关的动脉粥样硬化斑块形成。这证明,内皮细胞 PHACTR1 可以调控 DF 诱导的动脉粥样硬化。

内皮 PHACTR1 通过抑制小鼠血流紊乱下的 PPARγ 活性来促进内皮细胞活化和动脉粥样硬化

图1 全身Phactr1 KO(敲除)减轻Apoe−/−小鼠的动脉粥样硬化。

接下来,为了研究 PHACTR1 在内皮细胞对血流反应中的作用,实验检测了 PHACTR1 在不同剪切应力刺激的 ECs 中的表达。令人惊讶的是,EC PHACTR1 mRNA 的表达不受剪切应力的调节。在体内,Phactr1 mRNA 水平在假手术的 RCAs 和结扎的 LCAs 内膜中相当(图2 K、L)。体外在层流(LF)高剪切力(12 dynes/cm2)或振荡DF(±6 dynes/cm2,1 Hz)条件下,HUVECs 中 PHACTR1 mRNA 表达无明显差异(图2 M、N)。此外,在 LF 高剪切应力下,PHACTR1 主要集中在细胞质中,而在振荡 DF 或静态条件下,PHACTR1 集中在细胞核中(图2 O、P)。这些数据表明,LF 保留 PHACTR1 在细胞质中,而促动脉粥样硬化 DF 诱导了 PHACTR1 核易位。

然后研究了内皮细胞 PHACTR1 的分子功能,对小鼠主动脉ECs 进行了 RNA-seq 分析,显示 Phactr1−/− 小鼠的主动脉内皮细胞中有191个 DEGs,其中 KEGG 通路富集在代谢和炎症相关通路,而基因本体分析强调了与产热、血管发育和免疫反应相关的生物学过程。此外,功能分析表明,内皮细胞 Phactr1 的缺失主要影响炎症相关通路以及与血管功能和免疫反应相关的生物过程的改变。因此,综合全身和 EC特异性 Phactr1 KO ECs 中 DEGs 的生物信息学分析,研究人员认为内皮细胞 PHACTR1 参与血管功能和炎症反应。

考虑到 PHACTR1 的核定位,进一步鉴定了与 PHACTR1 相关的潜在转录因子,发现 PPARγ 和 RXRα 是排名前几的过度表达的转录因子。在具有潜在 PPARγ/RXRα 结合位点的 DEGs 中,大多数基因上调,这表明,内皮细胞 PHACTR1 的缺失增加了 PPARγ/RXRα 的转录活性。然后通过免疫共沉淀法探索了 PHACTR 1、PPARγ 和 RXRα 之间的潜在相互作用。PHACTR1 与 PPARγ 相关,但与 RXRα 无关,提示 PPARγ 是 PHACTR1 的直接效应分子。随后分析了 PHACTR1 在 PPARγ 信号传导中的作用,结果表明,PHACTR1 过表达显著抑制 PPARγ 激动剂 pioglitazone 诱导的激活,且 PHACTR1 通过 LXXXIXXX(I/L)基序与 PPARγ 结合,是一种潜在的 PPARγ 转录抑制因子。

内皮 PHACTR1 通过抑制小鼠血流紊乱下的 PPARγ 活性来促进内皮细胞活化和动脉粥样硬化

图2 内皮细胞Phactr1的缺失减轻了Apoe−/− 小鼠血流紊乱区域的动脉粥样硬化。

PPARγ 在动脉粥样硬化中具有保护作用。研究人员推测 PHACTR1 通过抑制 PPARγ 活性在促动脉粥样硬化血流中对 EC 激活起关键作用。在体外敲除 HUVECs 中 PHACTR1 后,发现静态条件下,PHACTR1 缺失抑制 HUVECs 中 VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白水平。应用振荡 DF 或 LF 处理后,PHACTR1 缺失降低了DF 诱导的 VCAM-1 和 ICAM-1 表达,并抑制 DF 诱导的 PBMCs 对 HUVECs 的粘附。重要的是,PHACTR1 敲低使 DF 下 HUVECs 中 PPARγ 的转录活性增加,且恢复了 VCAM-1 和 ICAM-1 的表达,这表明,PHACTR1 介导的 EC 激活是通过抑制 PPARγ 来实现的。在体内实验中,Phactr1−/− 小鼠 DF 区内皮细胞 VCAM-1 表达显著降低。在 Apoe−/− 小鼠部分结扎颈动脉引起的动脉粥样硬化病变中,内皮细胞 Phactr1 缺失使巨噬细胞浸润减少。这些结果表明,内皮细胞 PHACTR1 通过促进炎症粘附因子的表达和随后的白细胞浸润来促进动脉粥样硬化的进展。

实验研究了 PHACTR1 是否通过抑制 PPARγ 信号通路介导动脉粥样硬化,对 Phactr1ECKOApoe−/− 和 Phactr1f/fApoe−/− 小鼠进行部分颈动脉结扎,喂食 HF-HC,并注射 PPARγ 拮抗剂 GW9662(图3 A)。在 GW9662 给药下,两组小鼠之间的动脉粥样硬化斑块具有可比性(图3 B、C),CD68-阳性巨噬细胞在两组之间没有差异(图3 D、E ),这表明 GW9662 降低内皮 Phactr1 KO 的保护作用。此外,GW9662 还消除了 DF 诱导的 Phactr1 缺失引起的 Vcam1 和 Icam1 表达降低(图3 F、H)。这些结果表明,PHACTR1 通过抑制 PPARγ 信号介导 EC 激活和动脉粥样硬化。

内皮 PHACTR1 通过抑制小鼠血流紊乱下的 PPARγ 活性来促进内皮细胞活化和动脉粥样硬化

图3 PPARγ拮抗剂GW9662消除了Phactr1缺失对体内内皮活化和动脉粥样硬化的保护作用。
I 内皮细胞PHACTR1在内皮活化和动脉粥样硬化中的作用示意图。层流下,PHACTR1存在于细胞质中,PPARγ抑制炎症。在流动紊乱的区域,PHACTR1位于细胞核中,作为其转录共抑制因子与PPARγ相互作用,上调细胞表面粘附分子的表达。白细胞附着于内皮细胞并浸润到血管壁,促进动脉粥样硬化。

总之,该研究证明,内皮细胞 PHACTR1 是一种新的促动脉粥样硬化分子,通过调节 EC 激活作为 DF 下 PPARγ 的转录辅抑制因子。PPARγ 是一个理想的治疗靶点,PPARγ 激动剂已成为除代谢外的内皮功能保护剂。然而,由于 PPARγ 的普遍表达和功能的多样性,其不良反应如心力衰竭和肝功能障碍被观察到。因此,使用小肽或小分子阻断内皮细胞 PHACTR1 和 PPARγ 的关联可能是动脉粥样硬化等疾病的一种很有前途的治疗策略。

参考文献:Jiang D, Liu H, Zhu G, Li X, Fan L, Zhao F, Xu C, Wang S, Rose Y, Rhen J, Yu Z, Yin Y, Gu Y, Xu X, Fisher EA, Ge J, Xu Y, Pang J. Endothelial PHACTR1 Promotes Endothelial Activation and Atherosclerosis by Repressing PPARγ Activity Under Disturbed Flow in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Aug;43(8):e303-e322. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318173. Epub 2023 May 18. PMID: 37199156; PMCID: PMC10524336.
原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37199156/

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