流体剪切应力通过p38-AMOT-YAP促进牙周膜细胞增殖

牙周膜细胞（PDL）细胞是牙周再生治疗的有前途的工具。获得足够数量的PDL细胞对于PDL再生至关重要。PDL细胞的再生潜力已经在大型动物模型中进行了研究，并报道了其临床结果。然而，由于它们对组织资源和增殖能力的限制，开发有效的方法来扩增PDL细胞以进行牙周再生至关重要。

PDL位于牙槽骨和牙骨质之间，它持续感知机械力，例如正畸牙齿移动（OTM）或咀嚼过程中的拉伸应力、压应力和剪切应力。PDL细胞感知并响应机械应力，这对于组织稳态和重塑至关重要。

YAP是Hippo通路的共转录因子，在细胞增殖、迁移和分化中起重要作用。此外，YAP还具有机械转导特性。有研究报道，细胞骨架张力可以调节zyxin 蛋白，其介导人PDL成纤维细胞中YAP的核转运。然而，YAP是否参与剪切应力介导的PDL细胞增殖以及游调节因子尚不清楚。

基于此，北京航空航天大学生物与医学工程学院北京生物医学工程高精尖中心、生物力学与力学生物学教育部重点实验室的一项研究探讨了流体剪切应力（FSS）介导的牙周膜细胞增殖机制，研究结果为PDL细胞增殖作为PDL组织再生的可行方法提供了新的见解，对p38-AMOT-YAP机械转导的观察为牙齿运动和牙齿矫形提供了启示。

FSS促进PDL细胞增殖并重排细胞骨架和核形状

为了研究FSS对PDL细胞增殖的影响，用1、3、6和9 dyn/cm2的 FSS 持续4小时来量化EdU阳性PDL细胞。在这项研究中，1-6 dyn/cm2的FSS促进细胞增殖，但9 dyn/cm2的FSS抑制细胞增殖。此外，6 dyn/cm2 的FSS效果最好，EdU阳性细胞的数量从24.41%±4.01%增加到43.13%±6.03%（图1 A、B）。因此，实验选择了 6 dyn/cm2的FSS在随后的实验中。

将PDL细胞暴露于6 dyn/cm2的FSS，与静态对照相比，细胞保持了更高的活力（图1 C）。为了研究FSS对PDL细胞骨架重塑的影响，将PDL细胞暴露于6 dyn/cm2 FSS中持续5分钟，10分钟，30分钟，1小时，2小时和4小时，结果增加了F-肌动蛋白丝的密度（图1 D、E）。投影面积减小，细胞形状指数呈时间依赖性增加（图1 F、G），表明FSS可以将细胞形状改变为更小更圆。接下来，研究了FSS介导的细胞粘附。有趣的是，FSS似乎在二相模型中调节FAK和Paxillin。它在1-5分钟后增加了FAK和Paxillin的长度。然而，这些参数在FSS超过30分钟后下降（图1 D、H）。

当FSS持续5分钟-4小时时，核厚度在10分钟内下降，并在30分钟后增加。核面积在10分钟内增加，并在30分钟后降低（图1 I-K）。然而，FSS没有改变核体积（图1 L），表明在FSS的10分钟内，细胞核变得更平坦，但在30分钟后，它们达到了更立体的形状。肌动蛋白帽在10 分钟内增加，30 分钟后减小（图1 M、N），肌动蛋白帽的总荧光强度与核厚度呈高度相关（图1 O），表明FSS促进肌动蛋白帽扩增和压缩细胞核。然后进一步研究了FSS在10分钟内对核孔的影响。结果表明，5-10 分钟的FSS扩张了核孔径（图1 P、Q）。

图1 FSS促进PDL细胞增殖，重新排列细胞骨架，改变细胞核形状。

YAP参与FSS诱导的PDL细胞增殖

接下来研究了YAP在FSS诱导的PDL细胞增殖中的作用。结果表明，YAP在FSS的持续时间内显示出动态易位。它们在5-10分钟内响应FSS在细胞核中积聚。然而，在FSS持续的30分钟、1小时、2小时或4小时后，YAP被排除在细胞核之外。YAP比值的N/C与核厚度高度相关，表明核形状的变化影响YAP核定位。核转运抑制剂（LMB）阻断FSS诱导的YAP转录输出1小时，这表明核孔输出对于FSS诱导的YAP至关重要。YAP的Ser127是LATS1/2的关键靶点，FSS将其下调。YAP靶基因，如CTGF和ANKRD30，在4 分钟-2 小时FSS下被促进，表明下游基因被FSS持续激活。这些结果表明，尽管FSS诱导的YAP定位是动态的，但下游基因的激活及其抑制的磷酸化持续存在。当敲低YAP时，FSS诱导的细胞增殖被阻断。这些结果表明，FSS调控的YAP在FSS诱导的PDL细胞增殖中起关键作用。

LATS1/2是调节Hippo 通路中YAP激活的上游激酶。数据表明，FSS可以调节LATS1/2活性，从而调节YAP的定位和激活。当LATS1/2沉默时，即使在对照细胞中，FSS也未能促进细胞增殖。这些结果表明，LATS参与FSS诱导的YAP调控，并在FSS诱导的PDL细胞增殖中发挥作用。

p38通过调节PDL细胞中的LATS和YAP来调节FSS诱导的细胞增殖

据报道MAPK信号通路可调节YAP活性。在研究中，6 dyn/cm2 的FSS可以在5-30分钟内快速激活ERK、p30和JNK。当PDL细胞分别用ERK，p38和JNK抑制剂预处理时，p38抑制剂（而不是JNK和ERK抑制剂）减少了FSS诱导的YAP核聚集。被FSS降低的pYAP表达被p38抑制剂恢复，但JNK或ERK抑制剂不能。CTGF和ANKRD1的表达也有类似的趋势。因此进一步研究了p38的作用，发现FSS诱导的增殖被p38抑制剂显著破坏，但JNK和ERK抑制剂没有。由于FSS下调了pLATS1，实验发现只有p38抑制剂可以在FSS下挽救pLATS1表达。这些结果表明，p38通过抑制LATS磷酸化和促进YAP活性来调节FSS诱导的细胞增殖。

细胞骨架和LINC调控FSS诱导的YAP定位

已知YAP受细胞骨架高度调控。为了研究细胞骨架在FSS诱导的YAP定位中的作用，使用不同的细胞骨架抑制剂：细胞松弛素D（Cyto D）、Rho激酶抑制剂Y-27632、非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制剂Bleb，以干扰细胞骨架的不同方面。结果表明，FSS下肌动蛋白丝受损符合YAP的核排出。相反，当细胞与促进肌动蛋白聚合的诱导剂Jasp孵育时，FSS诱导的YAP的核定位增加（图2 A、B），表明肌动蛋白丝的完整性在FSS诱导的YAP定位中起重要作用。这些细胞骨架试剂也调节细胞核形状。细胞骨架抑制剂受损提高了核高度并减少了核面积。然而，Jasp具有相反的效果（图2 C-F）。已知LINC复合物将力从细胞质细胞骨架传递到细胞核。当沉默将肌动蛋白连接到LINC的nesprin1时，FSS诱导的F-肌动蛋白形成和YAP核定位受到阻碍（图2 G、H）。当nesprin1被敲低时，FSS促进的F-肌动蛋白和paxillin 也降低（图2 I）。沉默的nesprin1取消了FSS增加的肌动蛋白帽和核扁平化（图2 J-O）。这些结果表明，LINC对于FSS从细胞骨架到细胞核的转导至关重要，它参与了FSS诱导的YAP转运。

图2 细胞骨架和LINC参与PDL细胞中FSS诱导的YAP定位。

p38 影响 Akt/cofilin 和 LATS 以调节 FSS 诱导的 PDL 细胞中 F-肌动蛋白聚合

Akt和cofilin是调节肌动蛋白聚合的关键因子。实验结果表明，在FSS作用5-30分钟后，pAkt/Akt的表达增加，而Akt表达没有变化（图3 A）。此外，pcofilin/cofilin的水平也在FSS作用5-30分钟后上调，而cofilin水平没有影响（图3 B）。当cofilin沉默时，FSS上调YAP核定位，下游基因表达进一步增加，趋势与F-肌动蛋白形成相同（图3 C-G）。当使用Akt抑制剂MK2206和PI3K抑制剂LY294002时，FSS诱导的pcofilin表达受到抑制（图3 H）。当PDL细胞与p38抑制剂预培养并加载6 dyn/cm2的FSS 时，pAkt/Akt和pcofilin/cofilin，F-肌动蛋白的水平降低（图3 I-L）。这表明，p38对肌动蛋白聚合至关重要。

为了证明LATS1和Akt的关系，将MK-2206与PDL细胞一起孵育以抑制Akt活性。结果表明，被FSS降低的pLATS1/LATS1表达被Akt抑制剂恢复（图3 M）。相反，敲低LATS1/2几乎没有影响FSS介导的Akt活性。由于p38可以抑制pLATS水平，因此当沉默LATS1/2，F-肌动蛋白密度增加，并且对FSS没有反应（图3 N、O）。当LATS1/2被敲低时，对照组中肌动蛋白帽增加，FSS不能增强（图3 P、Q）。沉默LATS1/2进一步增加了FSS诱导的核扁平化，对FSS调节没有反应（图3 R-U）。这些结果表明，FSS激活了p38，随后激活了Akt，Akt磷酸化cofilin，促进了F-肌动蛋白聚合。Akt的激活参与了LATS磷酸化的抑制。受p38抑制的LATS负调节F-肌动蛋白，肌动蛋白帽形成和核扁平化。因此，FSS诱导的F-肌动蛋白聚合增加了YAP核易位。

图3 p38影响Akt/cofilin和LATS调节FSS诱导的PDL细胞中F-肌动蛋白聚合。

AMOT负调节FSS诱导的PDL细胞中YAP转运

据报道，AMOT家族可以与几种Hippo 通路成分相互作用并调节YAP活性。有趣的是，这些研究表明AMOT被转运到细胞核中，其模式类似于FSS诱导的YAP定位。AMOT N/C比相对于核厚度较高。FSS在5-10分钟内抑制AMOT的磷酸化。当沉默AMOT时，YAP核定位增加，对FSS没有反应。下游基因，如CTGF和ANKRD1，表现出相同的趋势。AMOT的敲低促进了FSS诱导的PDL细胞增殖。当AMOT被沉默时，FSS加速增殖不受FSS调控。这表明AMOT是一种负调节因子，是FSS诱导的YAP核定位和细胞增殖所必需的。为了研究潜在的机制，实验研究了AMOT与F-肌动蛋白和YAP的相互作用。结果表明，FSS可以增加AMOT与F-肌动蛋白的结合并减少AMOT-YAP相互作用。当沉默YAP时，AMOT-F-肌动蛋白相互作用在FSS下进一步增强。当通过Bleb抑制F-肌动蛋白聚合时，AMOT-YAP相互作用得到促进。当使用Jasp时，在FSS下AMOT-YAP相互作用降低。这些结果表明，AMOT可以与F-actin和YAP竞争性结合。F-肌动蛋白的聚合促进了AMOT与F-肌动蛋白的相互作用。

为了进一步研究AMOT的调控机制，实验发现siYAP抑制了FSS介导的AMOT核定位（图4 A、B）。当使YAP阴性调节因子LATS1/2沉默时，AMOT核定位增加并且对FSS没有反应（图4 C、D）。siLATS1/2也降低了它们的磷酸化（图4 E），表明LATS1/2可以调节pAMOT和FSS诱导的核定位。AMOT还可以调节LATS1的磷酸化。当沉默AMOT时，FSS抑制的磷酸化进一步下降，并且不再受FSS调节（图4 F）。这些结果表明，FSS抑制pLATS1，影响pAMOT及其核定位。AMOT可以磷酸化LATS1。AMOT的核定位部分取决于YAP核转运（图4 G）。

图4 YAP和LATS调节FSS诱导的AMOT磷酸化和定位。

（G）FSS如何调节p38并进一步影响YAP核易位以促进PDL细胞增殖的示意图。

在这项研究中，报道了FSS可以通过p38-AMOT-YAP促进PDL细胞增殖。FSS激活p38，抑制pLATS并上调YAP活性。此外，FSS诱导的p38表达还激活了Akt和pcofilin，促进了肌动蛋白帽和F-肌动蛋白聚合，使细胞核变平，扩增了核孔径，从而增加了YAP核易位。F-肌动蛋白招募AMOT进行结合并从YAP-AMOT复合物中释放YAP。研究结果表明，FSS是PDL细胞扩增的有前途的工具，还揭示了YAP机械转导的分子机制，这将有利于未来的牙齿再生。

参考文献：Shi Q, Zheng L, Na J, Li X, Yang Z, Chen X, Song Y, Li C, Zhou L, Fan Y. Fluid shear stress promotes periodontal ligament cells proliferation via p38-AMOT-YAP. Cell Mol Life Sci. 2022 Oct 16;79(11):551. doi: 10.1007/s00018-022-04591-w. PMID: 36244032.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36244032/

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