内皮细胞中流体剪切应力和硫酸吲哚酚对芳香烃受体的激活和组织因子诱导

慢性肾脏病（CKD）导致色氨酸代谢引起的尿毒症毒素的病理性积累，例如硫酸吲哚酚（IS）、吲哚乙酸（IAA）和犬尿氨酸。这些毒素是转录因子芳香烃受体（AHR）的激动剂，并诱导其在不同细胞（尤其是内皮细胞）中的活化。CKD患者AHR激动剂的积累是有害的，色氨酸来源的尿毒症毒素的许多有害作用与其AHR激活能力有关。

细胞色素P450 CYP1A1和CYP1B1 和AHR阻遏物（AHRR）受AHR基因组通路的调节。虽然AHR可以通过基因组通路直接调控转录，但它也可以通过在所谓的非基因组通路中激活信号分子和其他转录因子来间接调节基因表达。AHR介导的内皮组织因子（TF）调控就是这种情况，TF是凝血的主要引发因素。除了配体刺激外，AHR还可通过血流动力学力（如流体剪切应力）在内皮细胞中被强烈激活。有研究通过上调 CYP1A1 和 CYP1B1，证明了AHR激活取决于剪切应力的大小和时间平均值。

相比之下，通过诱导促动脉粥样硬化和血栓形成机制，吲哚类尿毒症毒素激活的AHR在很大程度上被证明对内皮细胞有害，并与心血管疾病有关。目前尚不清楚由尿毒症毒素诱导的病理性AHR激活如何影响内皮细胞对剪切应力介导的生理AHR激活的反应。因此，法国艾克斯-马赛大学、圣穆斯医院及阿尔及利亚奥兰大学生物学系的一项研究曾探讨了层流剪切应力和吲哚类尿毒症毒素硫酸吲哚酚对AHR的激活作用，检查了受 AHR不同调控的基因的表达，重点是TF。

剪切应力和IS对AHR和AHRR表达的影响

首先，实验研究了AHR及其阻遏物AHRR在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的mRNA表达，HUVEC 在5 dynes/cm2 的层流剪切应力和/或 200 μM的AHR激动剂IS暴露4小时和24小时。结果表明，层流剪切应力诱导AHR（图1 A）和 AHRR （图1 B）表达的持续增加。相反，IS刺激不影响AHR表达（图1 C），但增加 AHRR表达，并在4小时达到最大值，然后在24小时降低，但仍保持显著的高水平（图1 D）。

然后，使用AHR的小干扰RNA敲低（AHR siRNA）和AHR抑制剂CH223191 研究了AHR在剪切应力介导的AHRR上调中的作用。结果表明，AHR siRNA 和CH223191强烈抑制剪切应力诱导的AHRR上调（图1 E）。

当在剪切应力条件下用IS刺激内皮细胞时（图1 F），IS轻微增加了剪切应力诱导的AHRR的mRNA表达（图1 F）。在剪切应力条件下以及静态条件下，AHR siRNA对AHR的抑制显著降低了IS介导的AHRR诱导（图1 F）。

图1 剪切应力和硫酸吲哚酚（IS）对芳香烃受体（AHR）和AHR依赖性阻遏物（AHRR）表达的影响。

剪切应力和 IS 对 COX2、CYP1A1 和 CYP1B1 的上调具有 AHR 依赖的加性效应

接下来，实验研究了暴露于层流剪切应力和IS的HUVEC中AHR靶基因PTGS2（COX2），CYP1A1和CYP1B1的上调。层流剪切应力（图2 A）和 IS（图2 B）增加COX2 mRNA表达。在剪切应力条件下，COX2诱导量在4 h时最大，并在24 h时保持维持。IS诱导的COX2上调低于剪切应力诱导的COX2上调，无论何时（图2 B）。AHR siRNA和CH223191降低剪切应力诱导的COX2上调（图2 C）。AHR siRNA在静态条件下抑制IS对COX2的上调（图2 D）。当内皮细胞在剪切应力下用IS刺激时，IS扩增剪切应力诱导的COX2 mRNA的表达（图2 D）。在剪切应力和静态条件下，抑制 AHR显著降低了IS诱导的COX2上调（图2 D）。

然后研究了AHR参与CYP1A1和CYP1B1 mRNA的上调，以及剪切应力和IS对CYP1A1和CYP1B1上调的潜在加性效应。抑制 AHR强烈降低了剪切应力和IS诱导的CYP1A1和CYP1B1的上调。当内皮细胞在剪切应力条件下用IS刺激时，IS扩增剪切应力诱导的CYP1A1和 CYP1B1 mRNA的表达，这通过AHR siRNA抑制AHR后显著降低。

图2 剪切应力和IS对COX2上调的AHR依赖性加性效应。

染料木素抑制剪切应力和 IS 介导的 AHR 靶基因激活

然后实验分析了染料木素（Genistein）的作用，这是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，也可抑制AHR核易位。结果表明，染料木素强烈抑制所有剪切应力诱导的AHR靶基因：AHRR 、PTGS2（COX2）、CYP1A1和CYP1B1。此外，在静态和剪切应力条件下用IS刺激的HUVEC中，染料木素显著抑制了AHRR、 COX2、CYP1A1和CYP1B1 mRNA的上调。

剪切应力和 IS 上调的 TF 依赖于 AHR 的激活

接下来，实验将重点放在TF（由F3基因编码），并研究了其在暴露于层流剪切应力的HUVEC或用200 μM IS刺激的细胞中的AHR依赖性上调。

层流剪切应力（图3 A）和 IS 刺激（图3 B）以时间依赖性方式增加TF的mRNA表达。在剪切应力条件下，TF表达在4 h时增加，24 h时最大。IS诱导的TF上调具有相同的动力学特征，但低于剪切应力诱导的TF上调，与时间无关（图3 B）。在剪切应力条件下用IS刺激的内皮细胞中，IS扩增剪切应力诱导的TF mRNA表达（图3 F）。剪切应力和IS刺激也以类似的方式增加了4小时时TF的蛋白表达（图3 C）。此外，IS扩增剪切应力诱导的TF蛋白表达（图3 C）。

实验验证了AHR不与F3启动子结合以诱导IS刺激的HUVEC中的TF表达。ChIP 实验表明 AHR 在 F3 启动子上没有富集，表明 IS 刺激不会诱导 AHR 募集到 F3 启动子（图3 D）。正如预期的那样，AHR被募集到已知含有XRE序列的CYP1B1启动子中，在IS刺激HUVEC后（图3 D）。

最后分析了抑制AHR在剪切应力和IS诱导的TF中的影响。AHR siRNA 和 AHR 抑制剂CH223191显著抑制剪切应力诱导的TF表达（图3 E）。此外，在静态和剪切应力条件下，AHR siRNA对AHR的抑制显著降低了硫酸吲哚酚诱导的TF上调（图3 F）。

图3 由剪切应力和IS诱导的组织因子（TF）表达依赖于AHR激活。

染料木素抑制剪切应力介导的但不是硫酸吲哚酚介导的 TF 表达

此外，研究了染料木素对剪切应力和IS介导的TF mRNA诱导的影响。在静态条件下，染料木素显著降低剪切应力诱导的TF mRNA表达，但不抑制 IS 诱导的TF mRNA表达。在剪切应力条件下用IS刺激的HUVEC中，染料木素部分抑制了TF表达。在剪切应力和染料木素条件下，IS刺激的HUVEC中的TF mRNA表达与在无染料木素的静态条件下用IS刺激的HUVEC中的TF表达没有差异。这表明，在剪切应力下用IS刺激的HUVEC中，染料木素抑制剪切应力介导的TF诱导，而不是IS介导的。

硫酸吲哚酚在流体剪切应力下增加 TF 的促凝血活性

为了确定剪切应力和IS引起的TF产生增加是否对凝血具有功能活性，实验通过分析Xa因子（Xa 因子是凝血级联中的一种关键酶）的产生来测量HUVEC中TF依赖性促凝血活性。

剪切应力（图4）没有增加HUVEC中的TF促凝血活性。在静态条件下，IS 将 Xa 因子生成从对照细胞中的 0.96 ± 0.42 fM Xa/mg 蛋白增加到受 IS 刺激的细胞中的 6.28 ± fM Xa/mg 蛋白（图4）。在剪切应力条件下，IS仍然将Xa因子生成增加到2.93±0.97 fM Xa/mg蛋白，但这种增幅小于静态条件（图4）。阻断TF抗体消除了Xa因子的产生（图4），证实了 Xa因子的生成与 TF 活性相关。

图4 剪切应力和IS对TF促凝血剂活性的影响。

综上所述，该研究表明，剪切应力和IS通过不同的通路激活了AHR，但两者都以AHR依赖性的方式增加了TF表达。剪切应力不会诱导TF活性，而IS增加了TF活性，即使在抗血栓性剪切应力条件下也是如此。这支持了IS作为CKD中促血栓形成因子的作用。

参考文献：Lano G, Laforêt M, Von Kotze C, Perrin J, Addi T, Brunet P, Poitevin S, Burtey S, Dou L. Aryl Hydrocarbon Receptor Activation and Tissue Factor Induction by Fluid Shear Stress and Indoxyl Sulfate in Endothelial Cells. Int J Mol Sci. 2020 Mar 31;21(7):2392. doi: 10.3390/ijms21072392. PMID: 32244284; PMCID: PMC7178278.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32244284/

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