Smad4对静压力下PLGA三维支架人牙龈成纤维细胞Caspase-3及Bcl-2表达的影响

正畸治疗中其可将压力转化为生物信号由胞外传递到胞内，进而诱导一系列相关信号传递反应，影响牙龈组织改建过程。人牙龈成纤维细胞（HGFs）是牙龈组织的主体细胞，它们可以接收和传输信号。在过去的几十年中，尽管许多小组广泛研究了牙槽骨和牙周膜在压力下的重建，但牙龈重建的机制在很大程度上仍未得到探索。

在广西医科大学口腔医学院团队之前的研究中，发现静压力可以促进转化生长因子（TGF）-β1的表达和HGFs的增殖。TGF-β是调控细胞增殖和凋亡的重要生长因子，然而涉及TGF-β调控HGFs增殖和凋亡的因子和信号通路仍然未知。Smad4是TGF-β信号通路的关键下游因子，起着至关重要的调节作用。在经典的TGF-β通路中，激活的Smad2/3和Smad4形成SMAD复合物，其易位到细胞核。Smad4被认为是与细胞凋亡密切相关的肿瘤抑制基因。已经发现Smad4通过调控细胞凋亡相关蛋白来影响细胞凋亡，例如，Smad4在结肠癌中的低表达可以通过促进Bcl-2和Bcl-w表达来抑制细胞凋亡，并降低caspase-3 和caspase-9 的表达。因此，该团队假设Smad4可能在静压力作用下HGFs的增殖和凋亡中起关键作用。

可生物降解聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）已成为应用最广泛的生物支架材料之一。与其他支架材料相比，PLGA具有良好的生物学特性。与二维培养相比，三维（3D）培养可以更有效地模拟人体内部的自然环境，并提高实验结果的准确性和可靠性。因此，该团队建立了3D HGF-PLGA培养模型，探讨Smad4、caspase-3 和Bcl-2在调控HGFs增殖和凋亡通路中的作用，旨在进一步了解正畸牙龈重建的分子机制。

静压力诱导HGFs的增殖

首先，实验建立了三维PLGA-HGFs培养模型，如图1。与对照组（0 h）相比，HGFs在25g/cm2 的静压力下作用12、24和48 h后增殖能力显著提高，24 h达到峰值。随后当加力至72 h后，HGFs的增殖受到抑制，细胞活力降低。

图1 静压力负荷示意图。

静压力降低了 HGFs 中 Smad4 的表达

Smad4的基因和蛋白表达在静压力作用下显著下降，在24 h达到最低水平。随后，表达水平在48 h和72 h 时升高（图2）。

图2 静压力以时间依赖性的方式调节HGFs中的Smad4表达。

静压力作用下Smad4在HGFs中的mRNA（A）和（B）蛋白表达。

HGFs 中 caspase-3 和Bcl-2的表达随静压力的变化而改变

caspase-3 的基因和蛋白表达显著下降，在24 h达到最低水平。随后，其表达在48 h和72 h 增加。然而，Bcl-2的基因和蛋白表达量较对照组显著增加，24 h达到峰值。随后，表达水平逐渐降低（图3）。

图3 静压力以时间依赖性方式调节HGFs中细胞凋亡相关蛋白的表达。

在压力下半胱天冬酶-3和Bcl-2的mRNA（A）和（B）蛋白表达。

Smad4 mRNA和蛋白质水平评估

在用Lv-Smad4转染HGFs后72 h，增强型绿色荧光蛋白的表达效率为~90%。此外，基因和蛋白质表达分析显示，与Lv-对照组和空白对照组相比，Smad4 mRNA表达量在Lv-Smad4组显著上调（图4 ）。与空白对照组相比，Lv-对照组的Smad4 蛋白表达量显著下降，表明慢病毒系统有效递送外源性Smad4基因。

图4 用Lv-Smad4转染后人牙龈成纤维细胞中的Smad4基因和蛋白质表达。

用Lv-Smad4、Lv-对照或空白对照转染后Smad4 mRNA（A）和蛋白（B）的相对表达。

Smad4过表达抑制静压力对HGFs增殖的影响

CCK-8测定表明，HGFs的吸光度值随培养时间的增加而增加（图5）。前2天，Lv-Smad4组、Lv-对照组和空白对照组光密度（OD）值差异无统计学意义。然而，从第3天开始，Lv-Smad4组的OD值与Lv-对照组和空白对照组相比下降。此外，从第5天开始，3组之间差异均有统计学意义，空白对照组OD值最高，Lv-Smad4组OD值最低。此外，CCK-8结果显示Smad4参与了静压力诱导的HGFs增殖，如图5 B。与施加力前相比，Lv-Smad4组在静压力24 h后HGFs增殖没有显著增加（图5 B）。相反，在Lv-对照组和Lv-Smad4组中，连续静压力刺激24 h显著增加了HGFs增殖（图5 B）。

图5 Smad4过表达抑制静压力对HGFs增殖的影响。

（A）慢病毒转染后HGFs的增殖。（B）在压力作用下HGFs 的增殖。

Smad4过表达逆转了caspase-3 和Bcl-2在HGFs中的表达

为了确定Smad4在静压力下是否介导caspase-3 和Bcl-2的表达，实验在在HGFs中过表达Smad4。虽然连续静压力刺激24 h可显著降低Lv-Smad4组Smad4的表达，但Smad4表达量较Lv-对照组和空白对照组上调。此外，与对照组相比，在有或没有静压力刺激的情况下，Lv-Smad4组Bcl-2和caspase-3 的表达水平分别下调和上调（图6）。这些发现表明，Smad4是HGFs中重要的细胞凋亡相关因子，静压力通过下调Smad4的表达抑制HGFs细胞凋亡并促进增殖。

图6 Smad4过表达对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。

（A）Smad4、（B）半胱天冬酶-3和（C）Bcl-2基因和蛋白质在静压力下的表达。

综上所述，Smad4在静压力作用下通过调节caspase-3 和Bcl-2促进HGFs增殖。因此，Smad4可能是正畸治疗后预防牙龈增生的重要靶点。然而，该研究存在某些局限性。例如，仅使用CCK-8测定分析增殖和凋亡，应使用其他方法，例如流式细胞术。此外，关于Smad4的讨论仅限于增强Smad4的表达，随后的研究应该通过沉默Smad4来进一步验证这些发现。

参考文献：Zhao S, Nan L, Wang Y, Wei L, Mo S. Effects of Smad4 on the expression of caspase‑3 and Bcl‑2 in human gingival fibroblasts cultured on 3D PLGA scaffolds induced by compressive force. Int J Mol Med. 2021 Mar;47(3):04858. doi: 10.3892/ijmm.2021.4858. Epub 2021 Jan 26. PMID: 33495811; PMCID: PMC7846422.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33495811/

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