牙周膜干细胞中机械力诱导的自噬通过AKT信号通路调节M1型巨噬细胞极化

在牙齿移动过程中，牙周组织中形成无菌炎症微环境，其特征在于炎症细胞因子，趋化因子的表达升高和炎症免疫细胞的激活增加。作为牙周组织中的主要间充质干细胞（MSCs），牙周膜干细胞（PDLSCs）在牙齿移动过程中不断接受机械力刺激，参与炎症反应和骨重建过程。

自噬已逐渐被认为是在外部刺激（例如应激，炎症，缺氧和机械负荷）下维持细胞和组织稳态的重要保护性细胞过程。此外，自噬也可能适应机械负荷，可以在成骨细胞、内皮细胞和 PDLSC s等机械敏感细胞中被激活。然而，PDLSCs中的自噬是否影响机械力刺激下牙周组织的炎症微环境需要进一步探索。

在机械力诱导的炎症骨重建过程中，巨噬细胞被认为是重要的免疫细胞之一。在体内复杂的微环境中，其表现出独特的表型和功能：经典型巨噬细胞极化主要由M1型巨噬细胞构成，表现出与炎症和细胞毒性相关的功能，另一型巨噬细胞极化主要由M2型巨噬细胞构成，与组织修复和免疫调节相关。研究已经证实，M1巨噬细胞极化在牙齿移动期间的骨重建和牙根吸收过程中至关重要。

鉴于M1巨噬细胞极化在牙齿移动过程中的重要性，北京大学口腔医学院、山西医科大学口腔医院牙体牙髓科联合团队的一项研究曾假设PDLSCs中的自噬在机械力刺激下影响巨噬细胞极化，从而影响牙槽骨重建，研究旨在验证PDLSCs中力诱导的自噬是否以及如何调节巨噬细胞极化，并有助于牙周炎微环境和牙齿移动过程中的骨重建。

PDLSCs中力诱导的自噬有助于体内M1巨噬细胞极化

为了研究机械力是否可以激活自噬，建立了牙齿移动的实验动物模型，并使用抑制剂3-MA阻断自噬。机械力刺激7天后，牙齿移动距离增加，而注射3-MA可缩短此距离（图1 A）。机械力刺激后，自噬蛋白LC3、促炎细胞因子TNF-α和MSC表面标志物CD146在牙周组织受压侧的表达增加。同时，TRAP+ 破骨细胞数量也增加（图1 B、C）。3-MA可显著降低LC3、TNF-α和CD146的表达，以及TRAP+ 破骨细胞的数量。尽管如此，与对照组相比，机械力+3-MA组CD146 + MSCs 和TRAP+ 破骨细胞数量仍上调（图1 B、C）。

为了评估力诱导自噬对体内巨噬细胞极化的影响，进行了免疫荧光染色以鉴定力刺激后巨噬细胞标志物的变化。受力刺激后牙周韧带受压侧 CD68 + iNOS + M1巨噬细胞数量增加，3-MA注射后显著减少。虽然机械力+3-MA处理后CD68 + CD163 + M2巨噬细胞数量增加，但受力刺激后M1/M2巨噬细胞极化比显著增加，3-MA注射后显著降低（图1 D）。这些数据表明，自噬调节机械力刺激后的巨噬细胞的极化，并影响牙槽骨重建和牙齿移动过程。

图1 机械力诱导的自噬有助于体内牙齿运动过程中的M1巨噬细胞极化和骨重塑。

机械力激活PDLSCs中的自噬

为了探索机械力下的自噬活性，在体外对PDLSCs进行了蛋白质印迹，免疫荧光染色自噬通量测定和TEM。LC3是最重要的自噬相关蛋白之一。在12 小时的0.5-2.5 g/cm2的压缩力负荷下，LC3II/I的表达增加。然而，1.0和1.5g/cm2的压缩力触发了LC3II/I 的最强表达，随后在实验中使用 1.5g/cm2 压缩力。

压缩力刺激3 h后LC3II/I的表达量开始增加，并持续至24 h。此外，在压缩力刺激2、6h后，另一种自噬标志物P62/SQSTM（P62）的表达下降，而Beclin1的表达在力刺激3h后增加。实时荧光定量PCR显示，与对照组相比，Beclin1的mRNA表达明显上调。免疫荧光染色显示，在压缩力刺激12h后，PDLSCs中聚集的LC3阳性表达，在雷帕霉素应用后进一步增强。

用压缩力刺激细胞12 h，用显微镜检测自噬通量。结果表明，自噬溶酶体和自噬体的数量显著较高。此外，压缩力刺激后，TEM可在PDLSCs中发现明显的自噬体。这些数据表明，在压缩力刺激下，PDLSCs的自噬可以在压缩力依赖性和时间依赖性趋势中被激活。

力刺激的PDLSC自噬在体外诱导M1巨噬细胞极化

为了进一步检测力刺激的PDLSCs中的自噬是否会影响巨噬细胞极化，使用来自机械力刺激的PDLSCs（FS）、机械力刺激的PDLSCs + 3-MA处理（FS + 3-MA）或自噬激活剂雷帕霉素（FS + Rapa）的上清液来处理THP-1来源的巨噬细胞，无力加载作为对照（CS）（图2 A）。

FS组THP-1来源巨噬细胞中M1巨噬细胞相关标志物TNF-α和iNOS的mRNA表达水平上调，在FS + 3-MA组下调，而FS + Rapa组进一步上调。然而，未观察到M2巨噬细胞相关标志物精氨酸酶-1和DECTIN-1的表达（图2 B）。

免疫细胞化学分析显示，FS组CD68 + iNOS + M1巨噬细胞比例显著增加，在FS + 3-MA组部分被阻断，而FS + Rapa组增强。然而，CD68 + CD163 + M2巨噬细胞的比例没有改变（图2 C、D）。蛋白质印迹分析显示，FS组M1巨噬细胞相关标志物iNOS的表达显著增加，在FS + 3-MA组下调，而FS + Rapa组上调（图2 E）。然而，M2巨噬细胞相关标志物精氨酸酶-1的表达没有改变（图2 E）。仅应用3-MA或雷帕霉素不会改变THP-1巨噬细胞中TNF-α或精氨酸酶-1的表达。这些数据表明，在机械力刺激的PDLSCs中，自噬可以在体外引导巨噬细胞向M1表型极化。

图2 力刺激的PDLSC自噬在体外诱导M1巨噬细胞极化。

牙周膜干细胞自噬通过抑制AKT信号通路调节M1巨噬细胞极化

在验证了PDLSC自噬与巨噬细胞极化之间的关系后，实验最后探讨了其潜在机制。AKT信号通路已被公认为巨噬细胞存活和极化的关键介质。作为巨噬细胞中的关键转录因子，NF-κB 活性的增加引导巨噬细胞向M1表型极化。

实验发现，当将条件培养基应用于THP-1来源的巨噬细胞中时，FS组中磷酸化-AKT的表达受到显著抑制，而3-MA（FS + 3-MA）阻断自噬会增加磷酸化-AKT的表达，雷帕霉素增强自噬逆转了上述磷酸化-AKT水平的增加。相比之下，在机械力刺激的PDLSCs的上清液中孵育后，NF-κB / P65的表达上调，雷帕霉素进一步增强。

为了进一步确认调控机制，将AKT信号激活剂IGF1和抑制剂GSK690693应用于THP-1衍生的巨噬细胞。 FS + Rapa+ DMSO组TNF-α和NF-κB/P65的表达量增加，IGF1应用后降低（图3 A）。未观察到M2标记精氨酸酶-1的表达发生变化。在FS + Rapa+ DMSO组中，M1巨噬细胞相关标志物iNOS和TNF-α的mRNA水平一致升高，IGF1应用后下降，而M2巨噬细胞相关标志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 的mRNA表达无变化（图3 C）。

此外，FS + 3-MA + DMSO组TNF-α和NF-κB/P65的表达下降。应用GSK690693后，TNF-α和NF-κB/P65的表达在蛋白质水平上显著增加（图3 B）。在FS + 3-MA + DMSO组中，iNOS和TNF-α的mRNA表达水平一致下降，应用GSK690693后升高，而M2巨噬细胞相关标志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 表达无变化（图3 D）。这些数据表明，机械力刺激的PDLSCs中的自噬激活通过抑制AKT信号通路诱导M1巨噬细胞极化。

图3 PDLSC中力诱导的自噬通过AKT信号通路调节M1巨噬细胞极化。

图4 图形概要。

总之，PDLSCs中机械力刺激的自噬通过抑制AKT信号通路引导巨噬细胞进入M1表型，从而有助于骨重建和牙齿移动（图4）。这些结果有助于更好地了解PDLSCs如何响应机械刺激并与巨噬细胞极化的相互作用，从而调节牙槽骨骨重建。研究结果还表明，调节MSC自噬可能调节炎症性骨重建和再生过程。

参考文献：Jiang N, He D, Ma Y, Su J, Wu X, Cui S, Li Z, Zhou Y, Yu H, Liu Y. Force-Induced Autophagy in Periodontal Ligament Stem Cells Modulates M1 Macrophage Polarization via AKT Signaling. Front Cell Dev Biol. 2021 May 26;9:666631. doi: 10.3389/fcell.2021.666631. PMID: 34124048; PMCID: PMC8187804.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34124048/

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