柚皮苷抑制循环拉伸诱导的大鼠环状细胞凋亡，并通过抑制ROS/NF-κB通路部分减弱椎间盘退变

研究表明，由于过度的压力负荷，椎间盘细胞的凋亡减少了椎间盘中活性细胞的数量，从而减少了细胞外基质（ECM）的合成并改变了其组成，这是IVDD的重要病因。此外，发现线粒体和内质网介导的细胞凋亡通路参与了循环拉伸诱导的大鼠纤维环细胞（AF）细胞凋亡，然而，抑制这两种通路并不能完全阻止细胞凋亡。这表明循环拉伸诱导的椎间盘细胞凋亡的机制的复杂性。

ROS和氧化应激主要通过调节核因子κβ（NF-κB）通路、丝裂原活化蛋白激酶通路和磷脂酰肌醇3激酶通路，对各种骨骼和肌肉疾病产生致病作用。正常椎间盘组织的特征是缺乏血管引起的缺氧微环境。之前，氧化应激被认为与IVDD无关。然而，最近的多项研究证实，椎间盘细胞在椎间盘微环境中代谢体内氧气并产生ROS，从而作为调节ECM代谢、促炎因子表型、细胞凋亡、自噬和衰老的重要介质。

柚皮苷又称柚苷、柑橘苷，是一种天然的黄酮类化合物，具有多种生物学作用，包括抗氧化、血管生成和抗炎等。柚皮苷的保护作用主要通过调节各种器官中的各种酶促和非酶促抗氧化参数（增加GSH，GPx，SOD和CAT以及降低MDA）介导的。骨碎补（Rhizoma Drynariae）是一种传统中药，在中国通常用于治疗退行性椎间盘疾病和骨质疏松症，然而，其作用机制仍不清楚。研究表明，柚皮苷可抑制氧化应激诱导的髓核细胞和间充质干细胞凋亡，抑制炎症介质的释放，调节椎间盘ECM代谢，延缓IVDD。此外，已证实柚皮苷可以抑制疼痛介质的释放，缓解椎间盘性腰痛，并抑制IVDD。因此，柚皮苷可能是治疗IVDD相关疾病的合适候选者。然而，柚皮苷对循环拉伸诱导的椎间盘细胞凋亡的影响尚不清楚。

基于此，上海交通大学医学院附属新华医院脊柱中心、附属仁济医院中医科以及扬中市中医院骨伤科的研究团队曾探讨了柚皮苷对循环拉伸诱导的氧化应激、细胞凋亡和IVDD的影响及其体外和体内机制，为柚皮苷在IVDD治疗中的应提供了理论依据。

柚皮苷改善循环拉伸诱导的大鼠 AF 细胞凋亡

将大鼠AF细胞置于循环拉伸（0.5 Hz，20%）下36 h，体外实验组如下：对照组-静态细胞；拉伸组-未经柚皮苷处理（0 μg/mL）拉伸的细胞；柚皮苷处理组-以低（50 μg/mL）或高（100 μg/mL）浓度柚皮苷处理的拉伸细胞。拉伸36 h后，细胞逐渐表现出凋亡形态，用高浓度和低浓度柚皮苷处理可抑制这些作用。Hoechst 33258染色显示染色质固缩和核分裂显著增加，柚皮苷可有效抑制。流式细胞术分析进一步显示，对照组大鼠AF细胞凋亡率仅为2.3±0.8%，而拉伸组凋亡率提高至34.1±1.6%。此外，与拉伸组相比，柚皮苷高、低浓度组的细胞凋亡率显著降低。

柚皮苷抑制大鼠 AF 细胞中循环拉伸诱导的 Caspase-3 和 Caspase-9 的活化

循环拉伸36 h后，拉伸组cleaved caspase-3 （活化形式）和caspase-9 水平显著升高。相比之下，与拉伸组相比，柚皮苷高、低浓度组的cleaved caspase-3 和caspase-9 水平受到显著抑制。

柚皮苷抑制循环拉伸诱导的线粒体膜电位去极化和细胞色素C 释放

循环拉伸36 h后，可以发现其抑制了线粒体膜电位。与拉伸组相比，柚皮苷高、低浓度组线粒体膜电位显著增加，但未达到对照组水平。实验结果表明，柚皮苷抑制了AF细胞中循环拉伸诱导的线粒体膜电位去极化（图1 a、b）。此外，循环拉伸36 h后细胞色素C的胞质水平显著增加，但柚皮苷显著抑制了柚皮苷高、低浓度组细胞色素C向细胞质中的释放（图1 c、d）。

图1 柚皮苷对周期性拉伸诱导线粒体损伤的影响。

（a）循环拉伸36小时后用JC-1染色的细胞的代表性图像。（b）红绿荧光强度比值用于测定线粒体膜电位并进行半定量分析。（c）用于检测细胞质细胞色素C的代表性蛋白质印迹。（d）细胞质细胞色素C水平的半定量分析，和拉伸组比较。

柚皮苷抑制循环拉伸诱导的氧化应激

与对照组相比，拉伸组ROS和MDA水平显著升高，SOD和GPx水平显著降低。与拉伸组相比，高、低浓度柚皮苷处理组ROS和MDA水平显著下降，SOD和GPx水平显著升高。这些结果表明，柚皮苷可以抑制AF细胞中循环拉伸诱导的氧化应激。

柚皮苷抑制循环拉伸诱导的 NF-κB 信号通路的激活

与对照组相比，拉伸组p-Iκ Bα和p-P65的表达显著增加。与拉伸组相比，高、低浓度柚皮苷处理组p-IκBα和p-P65蛋白表达显著下降。此外，两组间总P65表达未见显著变化。这些结果表明，柚皮苷抑制了循环拉伸诱导的 IκBα/NF-κB通路的活化（图2 a、b）。

图2 柚皮苷对NF-κB通路标志物（蛋白质）水平的影响。

（a）代表性蛋白质印迹，显示柚皮苷对循环拉伸暴露 36 小时后 p-IκBα、p-P65 和 P36 蛋白表达的影响。（b）p-IκBα、p-P65 和 P65 表达的半定量分析。

柚皮苷延缓椎间盘退变

MRI 显示假手术组椎间盘正常。3个月后，高浓度和低浓度柚皮处理组的椎间盘MRI显示出比IVDD组更强的信号强度，IVDD组显示信号较弱。此外，使用Pfirrmann等级评估椎间盘退变程度，与IVDD组相比，高浓度和低浓度柚皮苷治疗组的椎间盘退变程度显著降低（更好），尽管两个处理组之间没有观察到显著差异。

柚皮苷略微降低 IVDD 分级

3个月后，对照组的椎间盘呈现正常或轻度蛇纹石外观，而IVDD组和两个柚皮苷处理组的椎间盘显示轻度至中度蛇纹石外观，轮廓反转，破裂或结构模糊。同时，与IVDD组相比，高浓度和低浓度柚皮苷处理组的退变程度略有下降，但差异不显著。

柚皮苷抑制 AF 细胞原位凋亡

在处理后3个月，与其他三组相比，对照大鼠的椎间盘内可见的凋亡细胞较少。同时，高浓度和低浓度柚皮苷处理组的细胞凋亡率显著低于IVDD组。

柚皮苷可抑制I型胶原蛋白和MMP-3原位表达的增加

I型胶原表达的增加是IVDD的指标。免疫组织化学显示，IVDD组I型胶原染色率高于假手术组。I型胶原蛋白在高、低浓度柚皮苷处理组中的表达低于IVDD组。作为一种分解代谢酶，MMP-3表现出与I型胶原蛋白相似的表达趋势。

柚皮苷抑制 IVDD 大鼠血清和椎间盘组织中的氧化应激

与假手术组相比，高、低浓度柚皮苷处理组血清和椎间盘中ROS和MDA水平升高，SOD和GPx活性显著降低。然而，与IVDD组相比，高、低浓度柚皮苷处理组的ROS和MDA水平显著下降，SOD和GPx活性显著增加。这些结果表明，柚皮苷可以降低大鼠静态和动态不平衡引起的氧化应激水平（图3 a、d）。

图3 柚皮苷对动态和静态力不平衡诱导的大鼠腰椎间盘退变（IVDD）氧化应激和p-P65表达的影响。

（a-d）柚皮苷对血清和椎间盘组织中氧化应激的影响：（a）活性氧（ROS）产生，（b）丙二醛（MDA），（c）超氧化物歧化酶（SOD）和（d）谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）水平。（e）柚皮苷对椎间盘p-P65表达的影响。p-P65在高浓度和低浓度柚皮苷处理组中的表达低于IVDD组。

柚皮苷抑制 p-p65 原位表达

免疫组织化学显示，p-P65在高浓度和低浓度柚皮苷处理组中的表达显著低于IVDD组。然而，两个组之间没有观察到显著差异（图3 e）。

综上所述，该研究表明柚皮苷可以通过抑制氧化应激和NF-κB信号通路的激活来减少循环拉伸诱导的AF细胞凋亡并延缓IVDD。因此，它可以作为IVDD的潜在治疗药物。然而，由于柚皮苷具有多种药理学特性，因此在临床应用之前应探索其对其他组织和器官的全身作用。

参考文献：Zhang YH, Shangguan WJ, Zhao ZJ, Zhou FC, Liu HT, Liang ZH, Song J, Shao J. Naringin Inhibits Apoptosis Induced by Cyclic Stretch in Rat Annular Cells and Partially Attenuates Disc Degeneration by Inhibiting the ROS/NF-κB Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2022 Feb 23;2022:6179444. doi: 10.1155/2022/6179444. PMID: 35251479; PMCID: PMC8890877.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35251479/

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