心脏分化通过黏着斑蛋白募集促进局灶性粘附组装

局灶性粘附（FAs）是复杂的多蛋白结构，通过将细胞骨架连接到细胞外基质（ECM）来介导细胞粘附，并通过翻译肌动蛋白应激纤维上的外力来促进细胞迁移。根据其数量、大小和组成，结合肌球蛋白-II的收缩力，FAs 作为机械传感器将机械力从细胞骨架传递和传导到ECM。细胞将来自周围环境的机械线索转化为细胞内生化信号的能力在机械活性组织（如心肌）中至关重要，其中协调的肌肉收缩取决于适当的机械性能和电耦合。在心脏组织内，机械力通过称为肋节的专用FA复合物传递到肌动球蛋白。肋节能将肌细胞膜，与肌原纤维、细胞外基质、还有肌纤维上特点的点位（肌节）连接起来，加强肌细胞膜的稳定性和强度，在一定程度上保护它们免收外力损伤。

黏着斑蛋白（Vinculin）是一种膜细胞骨架蛋白兼粘着斑组成蛋白，参与整合素粘附分子连接到肌动蛋白细胞骨架，在调节FA形成和周转中起关键作用，将肌节锚定在细胞膜上。事实上，在扩展形式（活性状态）下，黏着斑蛋白与踝蛋白（Talin）相互作用，直接影响整合素聚集，从而影响FA成熟。此外，在FAs中限制黏着斑蛋白决定了桩蛋白（Paxillin）的募集，而桩蛋白反过来又促进了参与FA形成的其他蛋白质的募集和相互作用。

研究证据都证实了黏着斑蛋白在肌动蛋白细胞骨架动力学中的重要作用，不仅在维持心脏组织的适当功能方面，而且在心脏形态发生方面。据文献报道，心肌中黏着斑蛋白的缺失导致粘附连接、间隙连接和结缔组织的不稳定，导致机械和电耦合不足。

整合素是介导细胞与细胞外基质黏附作用的主要因子，可以和其他因子产生协同作用，如局灶性黏附激酶（FAK）。此外，FAs也是张力依赖性细胞变化的主要调节因子。在心脏形态发生过程中，机械力是调节心脏分化所必需的。

为了提供更多关于FAs在细胞分化和细胞机械稳定性中的调节方面的实验证据，意大利东方皮埃蒙特大学健康科学学系研究团队的一项实验曾集中探讨了黏着斑蛋白和FAK在H9c2心肌细胞中的作用。研究内容发表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊题为“Cardiac Differentiation Promotes Focal Adhesions Assembly through Vinculin Recruitment”。

首先，通过GATA-4、Mef2c、Nkx2.5等心肌细胞的标志物的基因表达检测H9c2细胞的成肌分化。结果显示，在分化开始时两个早期心脏标志物GATA-4和Mef2c在4 天后表达上调。相反，心脏转录因子Nkx2.5在分化第7天才显著表达。为了进一步证实心肌细胞的分化，检测了心肌肌钙蛋白T（cTnT ，一种参与心肌细胞功能成熟的蛋白）的表达，结果显示，其在第7天显著上调。获得的结果证实了H9c2心肌细胞的正常分化。

鉴于FAs在心肌形成过程中的作用，接下来研究了部分黏着蛋白（adhesion proteins）的存在、定位和激活。

FAK是整合素信号途径中的重要信号转导分子，在参与心肌形成的多种信号通路的汇合中起着节点的作用。FAK被激活时表现为磷酸化，其中，Tyr397是FAK的一个关键位点，该磷酸化可招募Src家族激酶，进而促进参与心脏分化的其他信号通路。蛋白质印迹评估了FAK的活化，显示分化细胞在第4天和第7天的pFAK显著增加。抗FAK Ab染色结果显示，肌动蛋白相关的FAK信号在分化细胞中变得更加明显。

此外，还通过检测FAs的主要成分之一黏着斑蛋白来研究FA的形成和H9c2分化。通过蛋白质印迹分析总蛋白和亚细胞部分黏着蛋白表达和膜募集，结果显示，7天后分化细胞中的黏着斑蛋白表达和募集显著增强。

分化7天后，观察细胞的形态变化（长度）和每个细胞的FAs数量（图1）。细胞呈典型的心肌细胞样贴壁细胞形态，具有局灶黏附纺锤状特征。此外，随着时间的推移和分化，FAs中黏着斑蛋白的信号更加明显，证实了上述结果。值得注意的是，形态测量分析显示分化7天时FAs的长度显著增加，而且每个细胞检测到的FAs数量更高。

图1 通过黏着斑蛋白（红色）染色获得的H9c2细胞形态。图像表示4（A）和7（C）天的对照细胞以及4（B）和7（D）天的分化细胞。白色箭头表示粘连中的黏着斑蛋白。

最后，为了强调FAs在心脏表型中的重要性，H9c2心肌细胞在生长和分化培养基中承受5%伸长率和1 Hz频率的循环机械应力4和7天。结果显示，机械拉伸后，细胞定向和排列平行于张力方向（图2）。这些数据表明，机械拉伸可翻译心肌细胞中的定向信号。

此外，评估了H9c2分化过程中FAs的表达，结果显示，分化细胞和机械应力刺激的细胞的细胞膜中有很强的黏着斑蛋白信号，而在对照细胞中，黏着斑蛋白的存在主要与细胞质有关。有趣的是，形态计量学分析显示，代表分化细胞在第7天形成的FAs长度的高斯曲线发生了显著变化（图3）。这些数据证实了FAs的形态重组与机械应力之间的比例相关性。

图2 H9c2心肌细胞在静态（A、B）和动态（5% 底物变形，1 Hz频率）条件下（C、D）维持7天的形态特征。黑色箭头表示拉伸方向。

图3 在静态和动态（5% 基质变形，1 Hz频率）条件下，在生长和分化培养基中生长7天的H9c2粘连的形态分析（长度）。

图4 图形概要
通过FAs激活的机械转导通路高度参与心肌细胞分化，从而证实了它们在细胞骨架重排（cytoskeleton rearrangement）和心肌肌丝成熟（cardiac myofilament maturation）中的作用。

综上所述，这些发现确定了FAs对细胞骨架（F-肌动蛋白）重排的重要性，从而对心肌细胞分化产生了强烈影响。此外，FAs在传递心脏功能所需的机械线索方面发挥作用，概述了肋状体（cotamerares）和FAs在维持心脏收缩力方面的积极影响。FA组装缺陷与多种心脏疾病有关，如心肌病。这些发现为心血管组织工程和再生提供了有价值的见解，强调了FAs在心肌细胞分化过程中的关键作用，从而表明它们作为改善心肌病结局的再生靶点的潜在应用。然而，需要进行进一步的研究，以充分了解机械应力、FA 变化和心脏分化之间的联系。

参考文献：Carton F, Casarella S, Di Francesco D, Zanella E, D'urso A, Di Nunno L, Fusaro L, Cotella D, Prat M, Follenzi A, Boccafoschi F. Cardiac Differentiation Promotes Focal Adhesions Assembly through Vinculin Recruitment. Int J Mol Sci. 2023 Jan 26;24(3):2444. doi: 10.3390/ijms24032444. PMID: 36768766; PMCID: PMC9916732.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36768766/

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。如有任何的想法以及建议，欢迎联系小编。感谢各位的浏览以及关注！
微信搜索公众号“Naturethink”，了解更多细胞体外仿生培养技术及应用。