低流体剪切应力激活的Smad2/3信号通路介导动脉向内重塑

脊椎动物血管系统的设计使局部灌注与每个组织的代谢需求相匹配，从而优化功能并最终存活。例如，缺氧会在短时间内诱导扩张小阻力血管因子的分泌，而在长时间内则会诱导刺激血管生成因子的分泌。这些调整增加了受影响组织的大动脉的流量，诱导其向外重塑。相反，组织的萎缩会导致血管密度降低和供血动脉向内重塑。

排列在血管内表面的内皮细胞（ECs）传递来自血流动力学壁流体剪切应力（FSS）的信号以调节血管重塑。多项研究表明，增加或减少动脉血流的手术干预分别刺激向外或向内重塑。目前的证据支持内皮细胞编码FSS设定值介导体内平衡的模型。持续高于或低于这个值的FSS会引起向外或向内的重塑，从而使FSS恢复到原始值。相比之下，设定值附近的FSS稳定了血管。不同类型的内皮细胞的设定值不同，对应于特定血管类型的剪切应力生理水平。对于人脐静脉ECs（HUVECs），生理 FSS 在 10-20 dynes/cm2 的范围内，抑制炎症性NF-κB，而Smad1/5信号在此范围内被最大程度激活。

转化生长因子（TGF）-β/骨形态发生蛋白（BMP）家族成员通过信号传导调控细胞反应，包括从早期发育阶段到成年生活和疾病的增殖，分化和迁移。已经表明，TGF-β/BMP家族配体和受体在剪切应力调控血管稳态中的作用。

耶鲁大学心血管研究中心、罗格斯大学高级生物技术和医学中心、上海市免疫学研究所等研究团队以前的研究表明，Smad1/5在生理设定值附近的激活和核易位是由其受体Alk1和内皮糖蛋白触发的。流动激活是通过对循环TGF-β家族配体BMP9和BMP10的敏感性增加约20倍介导的。与血管稳定的作用一致，这些受体的突变或缺失会诱发脆弱且容易破裂的血管畸形。其他研究表明，相关的Smad2/3通路也被血流激活，但是，在这种情况下，激活被生理层流FSS抑制，并由振荡FSS激活，这是动脉粥样硬化易感区域的典型特征。这些结果促使该团队研究了Smad2/3信号在血流依赖性血管重塑中的作用。

剪切应力激活Smad2/3

用1-30 dynes/cm2 的FSS 处理 HUVECs 持续12 小时诱导 Smad2/3 核易位，其在低 FSS（1-5 dynes/cm2）下达到最大值，然后随着FSS达到生理范围（≥12 dynes/cm2）后显著降低（图1 A、B）。细胞排列的平行评估（图1 C）证实了对FSS的预期大小反应。两个Smad2/3 直接靶基因—纤连蛋白和整合素α5 的 qPCR 表明，它们的表达遵循相似的大小依赖性，在低 FSS 时达到最大值（图1 D、E）。这种反应被小干扰RNA（siRNA）介导的Smad2/3 缺失阻断，证实了它们对Smad2/3活性的依赖性。因此，ECs中的Smad2/3信号显示双相调节，在低FSS时最大。

TGF-β受体通常通过关键丝氨酸残基的C端磷酸化启动R-Smad信号传导。因此，实验研究了剪切应力强度（1-30 dynes/cm2）在12小时内对 Smad2/3 C 末端磷酸化（p-Smad2/3 C）的影响。在 12 小时的时间过程中，p-Smad2/3 在流动开始后约 2-4 小时达到峰值，然后下降到高于基线的平台期（图1 F）。然而，与核易位不同，p-Smad2/3在高FSS下没有降低。因此，虽然流动诱导p-Smad2/3 C，但它不像核易位那样对FSS大小表现出相同的双相依赖性。因此，在高FSS下抑制核定位和基因诱导必须涉及一种独特的机制。

图1 Smad2/3受剪切应力调节。

受体和配体的鉴定

为了确定哪些受体介导Smad2/3的流动激活，首先考虑了Alk5（TGFβR1），这是TGF-β的主要I型受体，还考虑了神经纤毛蛋白-1（Nrp1），基于最近的一份报告，它与Alk1和Alk5相互作用，并参与VEGFR2的FSS激活。结果表明，Alk5 和 Nrp1 是 Smad2/3 流动激活所需的关键受体，就像 Alk1 和内皮糖蛋白是 Smad1/5 流动激活所需的关键受体一样。

通过类比Smad1/5的流动激活中对BMP9或BMP10的要求，接下来讨论了可溶性配体的作用。无血清培养基中FSS未能激活细胞中Smad2/3，表示需要一个或多个循环因子。TGF-β是刺激Smad2/3活化的主要Alk5配体。然而，浓度为1 pg/mL-10 ng/mL的TGF-β2与剪切应力没有协同作用。由于流动增强了BMP9或BMP10对Smad1/5的激活，于是接下来测试了这些配体。结果表明，FSS对Smad2/3活化的增强是由于对BMP9而非相关配体的敏感性增加。

诱导的体内向内重塑

接下来使用部分颈动脉结扎模型检查了体内低流量介导的向内重塑。两个颈动脉分支的结扎（图2 A）急剧减少了血流，这通常导致内膜-内侧增厚和管腔面积减少30%至40%（图2 B）。对侧颈动脉血流也有代偿性增加，但向外重塑要少得多。实验首先讨论了低FSS是否在体内激活了Smad2/3。大鼠和小鼠的颈动脉结扎（图2 C、D）后颈动脉上游ECs中的Smad2/3核染色增加。通过EC特异性敲除（ECKO）Alk5降低了小鼠的这种作用。因此，Smad2/3在体内被低FSS激活，这需要Alk5。

此外，阻断Smad2/3激活是否会减少低流动诱导的动脉向内重塑。在野生型小鼠中，右颈动脉周长减少了18%，对应面积减少了33%，而Alk5 ECKO小鼠没有显著变化（图2 E）。这些数据表明，Alk5-Smad2/3信号通路是低流动诱导的向内动脉重塑所必需的。

图2 低流动诱导的体内向内重塑。

高FSS下的抑制

Smad2/3 的双相流动激活表明，在高 FSS 下激活的另一种通路拮抗 p-Smad2/3 核易位。敲除小鼠MEKK3通过激活TGFβR1-Smad2/3通路触发自发的向内动脉重塑。MEKK2 和 MEKK3 是在高 FSS 下诱导转录因子 Klf2 表达的途径中的上游组分。该通路介导eNOS和其他促进血管舒张和稳定血管系统的基因表达。因此，研究了siRNA介导的MEKK3缺失对Smad2/3信号流动激活的影响。敲低MEKK3在低剪切下影响不大，但在高FSS下消除了Smad2/3核转运的抑制（图3 A、B）。因此，高-流量抑制Smad2/3功能需要MEKK3。

接下来，测试了Klf2在这条通路中的作用。敲低Klf2后，ECs受到不同幅度的FSS。同样，Klf2缺失在低FSS下几乎没有影响，但在高FSS下阻止Smad2/3的抑制（图3 C、D）。eNOS是一种经过充分验证的Klf2靶基因。两种不同的抗eNOS siRNAs在高流量条件下对eNOS几乎完全敲低，但对Smad2/3核定位没有影响。这一结果表明，必须有其他靶基因介导Smad2/3活性的抑制作用。然而，Klf2调控了数百个EC基因的表达，这使得鉴定具有挑战性。因此需要更仔细地研究高剪切下核排斥机制。

图3 MEKK3和Klf2在高FSS下抑制Smad2/3。

Smad2/3连接区磷酸化

Smad2/3抑制的一个重要机制涉及连接N端MH1和C端MH2结构域的“连接区”区域中丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化。因此，实验测量了低FSS和高FSS下的Smad2/3连接区 的磷酸化。结果表明，在高FSS下，多个连接区域丝氨酸的磷酸化显著增加。为了确定这种机制是否介导高FSS下的核排斥，转染了四个关键残基中携带Smad3突变的细胞。该突变体在高剪切下保存细胞核。接下来又测试了MEKK3和Klf2在连接区磷酸化中的作用。任何一种蛋白质的缺失都减少了高FSS诱导的连接区磷酸化。这些数据共同表明，通过MEKK3-Klf2通路的高流量诱导的Smad2/3连接区磷酸化介导了高剪切下Smad2/3核易位的抑制。

已知的 Smad 连接区激酶包括丝裂原活化蛋白激酶（Erk、Jnk 和 p38）、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）、Rho相关蛋白激酶Akt、钙调素依赖蛋白激酶和糖原合酶激酶-3。然而，实验注意到CDK被Klf2抑制，并预测靶向CDKs将在高剪切下被激活，从而可能介导观察到的Smad连接区磷酸化。最近的研究表明，高FSS下的动脉ECs处于G1停滞晚期，表明CDK4或CDK2的激活。因此，实验专注于CDK2和CDK4。CDK2的敲低在高剪切下强烈阻断细胞中的核排斥，而CDK4 敲低几乎没有影响。此外，CDK2 敲低阻断连接区磷酸化。综合这些结果，得出结论，CDK2是连接区磷酸化所必需的。

接下来评估了Klf2调控的CDK抑制剂（CDKN2B、CDKN1A）的作用。CDKN2B的敲低而不是CDKN1A的敲低逆转了高流量下ECs中Klf2缺失的影响。因此，MEKK3-Klf2通路的CDKN2B下调，随后CDK2激活，介导Smad2/3连接区磷酸化和高FSS抑制。

CDK在体内的抑制作用

最后，研究了该通路是否在体内起作用。黄酮吡醇已被用于癌症患者的人体临床试验。然而，这种化合物在循环中的半衰期很短（∼30分钟）。注射高剂量（7.5 mg/kg）黄酮吡啶醇的小鼠肺动脉和股动脉的内皮显示p-Smad2核染色增加数倍（图4 A-D）。这些结果证实了CDKs在动脉血流下阻止Smad2/3核易位中的作用。接下来，讨论了这种处理是否会引起血管重塑。结果发现，注射3天中的2天的小鼠存活率更高，因此，根据该方案注射3周。肺血管系统在MEKK3 敲低后最容易重塑。对整个肺切片的检查显示，血管的平滑肌肌动蛋白（SMA）覆盖率显著增加（图4 E），右心室血压显著升高（图4 F）。

这些数据共同定义了一条通路，其中MEKK3-Klf2-CDK2通过Smad2/3连接区磷酸化抑制高FSS下的Smad2/3核易位，以限制生理流大小的向内重塑。

图4 CDK在体内的抑制作用。

总之，该文分析了调节动脉管腔大小的信号网络，从而分析了它们将血液输送到组织的能力。管腔直径处于严密的稳态调节下，以使动脉血流与下游组织的需求相匹配。然而，在动脉粥样硬化中，这种调控受到破坏，导致血流受限和组织缺血。阐明Smad2/3通路在低流量下被特异性激活以触发向内重塑，从而恢复正常的剪切应力水平，不仅揭示了生理调节的机制，而且还解释了病变动脉中炎症因子激活同一通路如何导致动脉受限。

参考文献：Deng H, Min E, Baeyens N, Coon BG, Hu R, Zhuang ZW, Chen M, Huang B, Afolabi T, Zarkada G, Acheampong A, McEntee K, Eichmann A, Liu F, Su B, Simons M, Schwartz MA. Activation of Smad2/3 signaling by low fluid shear stress mediates artery inward remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Sep 14;118(37):e2105339118. doi: 10.1073/pnas.2105339118. PMID: 34504019; PMCID: PMC8449390.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34504019/

小编旨在分享、学习、交流生物科学等域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。
微信搜索公众号“Naturethink”，了解更多细胞体外仿生培养技术及应用。