小鼠肺类器官对减少、增加和循环拉伸的反应

大多数肺部疾病与肺某些区域的应变降低（例如肺炎、特发性肺纤维化、先天性膈疝 （CDH）或增加（例如肺气肿、哮喘）有关。胎儿腔内气管阻塞术（FETO）是一种新兴的CDH治疗方法，可以在宫内达到改善肺发育的目的。美国辛辛那提儿童医院医疗中心及辛辛那提大学医学院的研究团队曾使用CDH和FETO作为肺力学重要性的案例研究，因为CDH，气管阻塞（TO）和正常状态分别代表三种不同的机械力学发育环境：拉伸应变减少，拉伸应变增加和循环拉伸应变。这三种状态在肺发育的细胞培养或类器官模型中均未被考虑。

体外力学模型主要集中在经受单轴或双轴应变的二维（2D）表面上培养的细胞。这些还原论模型为特定细胞类型的机械反应性提供了重要的见解。例如，在培养的肺成纤维细胞中，瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员4（TRVP4）是关键的机械转导调节因子，而Piezo1在调节肺上皮细胞分裂以响应张力中很重要。然而，理解这些发现在体内的相对重要性和评估细胞-细胞或细胞-基质相互作用是困难的。

该团队使用动物肺的体内模型克服了其中的一些困难，但机械输入不容易操纵，人类细胞也不容易研究。为了克服这些限制，其开发了两种机械转导的肺类器官模型。第一种是类器官破坏（DIS）或佛司可林（FSK）诱导的类器官肿胀的简单模型，以研究静态应变增加和减少的影响。FSK增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，并已被证明可引起人鼻上皮类器官的类器官肿胀。第二个模型是将循环拉伸应用于类器官。这是第一篇描述减少、增加和循环的拉伸对肺类器官基因表达影响的研究。

FSK介导的肿胀和类器官破坏模型

为了在类器官模型中模拟气管阻塞和先天性膈疝的影响，对小鼠肺类器官（mLOs）进行了破坏和FSK介导的肿胀实验。FSK在4小时和20小时诱导mLO横截面积增加37%和59%，而破坏分别导致mLO横截面积减少 48%和68%。对照mLO横截面积在同一时间内分别增加了7%和24%，与正常的类器官生长一致（图1 A）。在破坏前（图1 B）、破坏后立即（图1 C）和破坏后20小时（图1 D）进行活细胞膜染色的mLOs双光子共聚焦显微镜图像显示，类器官壁出现相当大的破坏，类器官大小减小。

图1 小鼠肺类器官（mLOs）FSK和破坏模型。

FSK和DIS小鼠肺类器官中机械敏感基因的鉴定

这种实验方法的一个挑战是区分那些对FSK敏感的基因和那些对机械敏感的基因，了解一些基因可能两者兼而有之。结果发现，FSK诱导了近三分之一的细胞外基质基因，并且该实验模型偏向于显示机械转导基因诱导。在排除FSK敏感基因之前，FSK / DIS和FSK紧密聚集在一起，但在去除这些基因后，FSK/DIS 与 DIS更紧密聚集在一起。仅使用DIS，FSK和对照组进行基因集富集分析。排除这些转录本后，保留了11805个基因并进行了分析。将转录本限制在校正P值<0.1且表达有两倍变化的转录本中，FSK与对照组的转录本为715个，DIS与对照组的转录本为1081个，FSK与DIS的转录本为760个。

受FSK诱导的类器官肿胀和类器官破坏影响的通路和过程

令人惊讶的是，FSK 与对照组以及 DIS 与对照组数据集之间存在 344 个共享的 DEGs，被激活的基因主要参与细胞周期和先天免疫相关过程。

尽管FSK和DIS都改变了细胞骨架组织，但只有DIS下调了与管发育、呼吸系统发育和细胞粘附相关的过程。FSK与对照组相比没有显著差异，但DIS下调了许多与糖胺聚糖和鞘糖脂代谢相关的通路。DIS和FSK都增加了与免疫反应相关的基因表达，尽管系统中不存在免疫细胞。IPA分析鉴定了许多常见的细胞增殖调节因子，例如Yes相关蛋白（YAP）和FOXM1，与FSK相比，干扰素和转化生长因子β（TGF-β）在DIS中的预测调节作用降低。调控网络分析发现了许多相同的调控元件，DIS中的干扰素反应因子降低，泛素和趋化调节因子在DIS中增加。尽管集落刺激因子-2 （CSF2）、Erb-b2 受体酪氨酸激酶 2（ERBB2）和表皮生长因子受体（EGFR）等调节因子在 DIS 和 FSK 中均升高，但 FSK 中的调节因子通常更高，这表明 FSK 的细胞增殖受可溶性因子的影响更大。

为了验证这些发现，对PCNA阳性细胞进行了流式细胞术。与其他组相比，FSK mLOs显示出细胞增殖增加的证据。总之，尽管这种mLO FSK和DIS实验设计降低了识别FSK敏感基因变化的能力，但该模型表明，增加的机械应变会激活细胞周期，尽管FSK不会促进间充质细胞谱系基因和相关调控通路的发展，但DIS确实抑制了它们。

循环拉伸模型

为了表征mLO基因表达响应循环拉伸的差异，开发了循环拉伸实验装置，该装置可以在组织培养中对嵌入的肺类器官施加双轴循环拉伸（0.1 Hz，10.25%，20h）。在未拉伸状态和拉伸状态之间可以观察到明显的mLO体积增加。使用双光子共聚焦显微镜测量硅胶插入物内基质胶的高度和三个mLOs在基线和拉伸后的体积。结果表明，基质胶高度的测量显示体积减少了7.6%，但类器官体积的测量显示体积增加了约50%。这些数据表明，将循环双轴应变应用于mLOs会导致类器官体积的周期性变化。

循环机械拉伸对mLO基因表达的影响

实验对类器官进行了20小时的循环拉伸，并从这些mLOs 中提取RNA，mLO 承受相同大小的静态拉伸以及不施加拉伸。PCA揭示了静态和无拉伸mLOs之间的相似性，以及这两组和循环拉伸mLOs具有良好的分离性（图2 A）。由于静态和无拉伸mLOs相似，将它们与对照循环拉伸mLOs进行比较，以确定循环拉伸是否激活了与细胞外基质结构和组织、细胞-基质粘附和间质发育相关的GO生物过程。结果表明，与先天免疫相关的过程下调（图2 B）。GO分子功能项的统计学强度相对较弱，其中“蛋白激酶活性”增加，“单糖结合”和“氧化还原酶活性”降低最为显著（图2 C）。ToppGene通路分析发现，通过整合素进行的细胞-基质相互作用在循环拉伸中最为显著地上调（图2 D）。与静态拉伸和无拉伸相比，循环拉伸降低了大量与肺上皮细胞相关的基因丰度，并增加了与平滑肌细胞和成纤维细胞相关的基因数量（图2 E）。与GO分子功能类似，基因家族分析受到统计功效的限制，fermitins 上调，peroxiredoxins 降低。Fermitins调节整合素-基质相互作用。IPA上游调控（图2 G）和主调控（图2 H）分析结果表明：1）循环拉伸通过SIRT3改变组蛋白乙酰化；2）STAT信号，MAP激酶激活和转化生长因子α上调；3）TGF-β和MyD88信号降低，microRNAs和长非编码RNAs的变化可能介导许多观察到的基因表达变化。这些数据表明，循环拉伸促进从上皮细胞功能向细胞外基质和间质细胞的成熟和组织的转变。

图2 循环拉伸模型的mLOs分析。

循环拉伸对间充质细胞变化的影响

已知许多由循环拉伸改变的通路在间充质细胞发育中很重要，因此实验量化了在无拉伸、静态拉伸或循环拉伸下的类器官嵌入20小时后α平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性和血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）阳性细胞的百分比。结果表明，循环拉伸导致αSMA阳性和αSMA-PDGFRα双阳性细胞几乎翻倍，但PDGFRα阳性细胞的总丰度没有增加（与该受体在几种细胞类型中表达一致，图3 A-D）。这些数据支持循环拉伸在肺间充质细胞成熟中的作用。

图3 肺成纤维细胞在循环拉伸下的变化。

总之，研究发现，在该mLO模型中，增加和减少的静态拉伸诱导细胞增殖，应变的不断降低会下调许多肺部发育通路，而增加的应变会激活细胞周期，但对肺部发育通路没有影响。循环拉伸促进几种不同肺间充质细胞谱系的发育，激活TGF-β和表观遗传和转录后调控机制，并增加αSMA和PDGFRα阳性细胞的丰度。循环拉伸对于肺间充质细胞相关过程很重要。

参考文献：Joshi R, Batie MR, Fan Q, Varisco BM. Mouse lung organoid responses to reduced, increased, and cyclic stretch. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2022 Jan 1;322(1):L162-L173. doi: 10.1152/ajplung.00310.2020. Epub 2021 Dec 1. PMID: 34851724; PMCID: PMC8794016.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34851724/

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