HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

压缩是正畸牙齿移动(OTM)期间正畸压缩力(CF)诱导的特定微环境的标志之一,因为它能够影响成牙骨质细胞稳态。在OTM期间,压缩力会触发牙周膜(PDL)的炎症性破骨细胞生成和重塑过程,以进一步产生免疫抑制性缺氧微环境,从而损害OTM的过程。由于正畸诱导的炎症性牙根吸收(OIIRR)是正畸牙齿移动的一种严重副作用,因此压缩力对牙骨质生理学的作用越来越受到关注。成牙骨质细胞是调节牙骨质稳态以及通过参与先天免疫防御来预防OIIRR的负责细胞群。因此,这些细胞在基础正畸研究中得到了深入研究,特别是关于它们对正畸压缩力或牙周病原体及其成分(如肽聚糖)的反应。


牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)是一种革兰阴性厌氧菌,被认为是慢性牙周炎进展的关键病原体之一。牙龈卟啉单胞菌细胞壁的一个组成部分是肽聚糖(PGN)。牙龈卟啉单胞菌PGN是一种普遍存在的细菌成分,尽管它具有众所周知的强大促炎特性,但也可能在免疫防御反应中发挥作用。已知它可以刺激人牙龈角质形成细胞中丰富的PD-L1蛋白表达,但这尚未在成牙骨质细胞中得到证实。重要的是,牙周致病菌之一的牙龈卟啉单胞菌与正畸力(CF)相互作用的分子和细胞机制在成牙骨质细胞中尚不了解。


缺氧诱导的PD-L1表达已在多种原发性和各种癌细胞类型中发现。缺氧诱导转录因子(HIF)是正畸力转录反应的关键调节因子,据报道可调节成牙骨质细胞的凋亡过程。然而,目前尚不清楚HIF-1α是否调节成牙骨质细胞中 PD-L1 的表达。去年,德国尤斯图斯·李比希吉森大学医学院口腔正畸学系、牙周病学系的一项研究观察结果强调了理解PD-L1表达在成牙骨质细胞中如何调节的机制的重要性。


HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用


牙龈卟啉单胞菌 PGN 触发成牙骨质细胞中 PD-L1 的上调


首先,实验采用所有方法验证了不同浓度的牙龈卟啉单胞菌PGN感染后PD-L1在成牙骨质细胞中表达的动力学。结果发现,用牙龈卟啉单胞菌PGN刺激成牙骨质细胞导致PD-L1蛋白表达以浓度依赖性方式上调,在100 μg/mL时达到峰值。PD-L1的IF染色结果显示,牙龈卟啉单胞菌PGN(100 μg/mL)感染细胞中PD-L1的表达明显高于未受刺激细胞。RT-qPCR基因表达分析显示,100 μg/mL牙龈卟啉单胞菌PGN 刺激24 h后,PD-L1 mRNA水平明显高于孵育开始时间点(0)。


这些数据表明,牙龈卟啉单胞菌PGN以剂量和时间依赖性方式显著上调了成牙骨质细胞中的PD-L1分子表达,从4小时开始,在8小时后达到峰值,然后在12小时后衰减至48小时。



压缩力触发 OCCM-30 细胞中 PD-L1 和 HIF-1α 的表达


由于压缩是正畸诱导微环境的主要组成部分之一,因此,首次在永生化小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30上研究CF对免疫检查点之一的程序性死亡受体配体1(PD-L1)表达的影响。结果表明,载荷量为 2.4 gf/cm2 的CF在8、12和24小时内显著增加了PD-L1 在mRNA和蛋白质水平上的表达(图1 B、C)。同样,通过PD-L1的免疫荧光染色可见,CF组表达强烈上调(图1 D)。


进一步研究了CF是否可以诱导OCCM-30细胞中的HIF-1α表达。结果表明,CF显著增加了成牙骨质细胞中HIF-1α蛋白和基因的表达。还观察到HIF-1α在压缩细胞中含量丰富。


因此,这些结果表明,压缩力导致成牙骨质细胞中PD-L1轻微上调,促进了HIF-1α的表达。


HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

图1 响应压缩力的OCCM-30细胞中PD-L1和HIF-1α的上调。

用正畸力(2.4 gf/cm2)压缩成牙骨质细胞培养物,在不同时间段(1,2,4,6,8,12和24小时)。(A)生理细胞培养条件和受压缩力(CF)刺激的细胞的照片。(B、C)通过免疫印迹法测定PD-L1蛋白表达,并通过IF染色检测其定位。(D)在指定时间点压缩力下培养的OCCM-30细胞中PD-L1基因表达的RT-qPCR定量。(E、F)通过蛋白质印迹法测定HIF-1α蛋白表达。采用IF法评估HIF-1α定位。(G)在指定时间压缩力下培养的OCCM-30细胞中HIF-1α基因表达的RT-qPCR定量。



压缩介导牙龈卟啉单胞菌PGN触发的PD-L1在成牙骨质细胞上的表达


WB分析显示,PD-L1在牙龈卟啉单胞菌PGN感染的成牙骨质细胞中表达上调(图2 A-D)。重要的是,特别是在与CF和牙龈卟啉单胞菌PGN共刺激24小时后,PD-L1蛋白表达增强。与对照组(7.19±0.60%)相比,牙龈卟啉单胞菌 PGN或CF也增加了坏死性凋亡的比例(分别为11.22±0.75%;14.79±1.84%)(图2 E、F)。牙龈卟啉单胞菌PGN联合CF显著增加成牙骨质细胞坏死性凋亡(39.55±4.51%)(图2 E、F)。这些结果表明,压缩力可以调节牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1表达并参与成牙骨质细胞的坏死性凋亡。


HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

图2 压缩力以及牙龈卟啉单胞菌PGN触发PD-L1表达并参与坏死性凋亡调节。在存在或不存在压缩力(2.4 gf/cm2)的情况下,用确定浓度的牙龈卟啉单胞菌PGN(100 μg/ mL)处理成牙骨质细胞。(A-D)在存在或不存在CF的情况下,PD-L1在牙龈卟啉单胞菌PGN处理的细胞上表达水平的蛋白质印迹分析。(E、F)通过流式细胞术分析显示了膜联蛋白-V FITC和PI染色的代表性图。坏死性凋亡率(Annexin-V FITC+/PI+)显示在右上象限。图形显示了在存在或不存在压缩力的情况下,暴露于牙龈卟啉单胞菌PGN的坏死性凋亡细胞的百分比。



压缩作用下牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1和HIF-1α在成牙骨质细胞中的相关性


为了探讨牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1表达是否依赖于HIF-1α,使用了HIF-1α抑制剂IDF11774。WB结果表明,HIF-1α在压缩作用下的阻断显著消除了牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1蛋白上调(图3 A、B)。IF染色显示,在牙龈卟啉单胞菌PGN刺激下,抑制 HIF-1α对诱导性PD-L1表达具有显著抑制作用(图3 C)。此外,在与IDF11774共刺激24小时后,观察到细胞坏死性凋亡(图3 C、D)。在存在压缩力的情况下,IDF11774增加了坏死性凋亡细胞的百分比。牙龈卟啉单胞菌PGN加CF组坏死性凋亡细胞的百分比也有所增加(图3 E)。因此,这些证据表明,HIF-1α是压缩力下牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1 mRNA和蛋白质表达的主要调节因子。


HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

图3 牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1表达取决于OCCM-30细胞在压缩力下的HIF-1α信号。将OCCM-30细胞与不同浓度的HIF-1α抑制剂IDF11774预孵育2 h,然后分别用牙龈卟啉单胞菌PGN结合压缩力刺激24 h。

(A、B)响应IDF11774(20 uM)的PD-L1蛋白水平的蛋白质印迹分析。(C)代表性IF染色显示24小时后PD-L1在存在或不存在IDF11774的情况下在牙龈卟啉单胞菌PGN刺激的OCCM-30细胞中表达。(D、E)计算暴露于HIF抑制剂的坏死性凋亡细胞的百分比以及与牙龈卟啉单胞菌PGN和CF共同刺激的坏死性凋亡细胞的百分比。(F)OCCM-30细胞可以在体外释放可溶性GAS-6,如果HIF-1α被抑制剂阻断,这种作用就会受损。此外,牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的GAS-6释放被HIF-1α阻断剂拮抗。



HIF-1α 通过减少 GAS-6 分泌参与成牙骨质细胞的免疫调节


据描述,可溶性GAS-6在PDL细胞的稳态中发挥免疫调节作用。因此,实验旨在分析OCCM-30细胞是否可以释放GAS-6,并且在存在或不存在HIF-1α抑制剂的情况下,通过与牙龈卟啉单胞菌PGN和/或CF的共同刺激是否可以改变其表达。结果表明,OCCM-30细胞具有释放GAS-6(27.67 ±11.15 pg/mL)的特性,并且该释放对IDF11774(18.04 ± 8.43 pg/mL)的使用无显著影响(图3 F)。用牙龈卟啉单胞菌PGN处理不会改变GAS-6的产生。有趣的是,在CF和CF加牙龈卟啉单胞菌PGN刺激条件下,IDF11774导致GAS-6的释放分别降低至10.72±1.82 pg/mL和19.33±8.84 pg/mL。因此,这些结果表明,GAS-6是成牙骨质细胞的免疫调节剂,可以通过HIF-1α被释放和调节。


HIF-1α在压缩力下调节(肽聚糖诱导的)成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

图4 该方案描述了HIF-1α在成牙骨质细胞中的作用方式:牙龈卟啉单胞菌PGN刺激了成牙骨质细胞的PD-L1上调。压缩力诱导OCCM-30细胞表达HIF-1α和PD-L1。牙龈卟啉单胞菌PGN和压缩力的共刺激调节PD-L1表达,增加OCCM-30细胞坏死凋亡比。抑制HIF-1α可抑制PD-L1表达以及可溶性GAS-6的产生。因此,HIF-1α在压缩力作用下调节成牙骨质细胞中PGN-诱导的PD-L1表达中起重要作用。


基于体外小鼠成牙骨质细胞模型,该研究表明,牙龈卟啉单胞菌PGN上调了成牙骨质细胞的PD-L1,并且这种效果通过HIF-1α响应压缩力而维持。激活HIF-1α调节成牙骨质细胞的坏死性凋亡。阻断HIF-1α可通过减少GAS-6释放来消除成牙骨质细胞的免疫反应。


该数据首次表明,在正畸诱导的微环境下,免疫检查点PD-L1与HIF-1α在成牙骨质细胞免疫抑制中相关。此外,通过使用HIF-1α和PD-L1靶向抑制,在OTM期间对牙周炎个体进行OIIRR的免疫治疗可能有助于免疫反应。



参考文献:Yong J, Gröger S, Meyle J, Ruf S. Immunorthodontics: Role of HIF-1α in the Regulation of (Peptidoglycan-Induced) PD-L1 Expression in Cementoblasts under Compressive Force. Int J Mol Sci. 2022 Jun 23;23(13):6977. doi: 10.3390/ijms23136977. PMID: 35805974; PMCID: PMC9266671.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35805974/


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