HIF-1α在压缩力下调节（肽聚糖诱导的）成牙骨质细胞PD-L1表达中的作用

压缩是正畸牙齿移动（OTM）期间正畸压缩力（CF）诱导的特定微环境的标志之一，因为它能够影响成牙骨质细胞稳态。在OTM期间，压缩力会触发牙周膜（PDL）的炎症性破骨细胞生成和重塑过程，以进一步产生免疫抑制性缺氧微环境，从而损害OTM的过程。由于正畸诱导的炎症性牙根吸收（OIIRR）是正畸牙齿移动的一种严重副作用，因此压缩力对牙骨质生理学的作用越来越受到关注。成牙骨质细胞是调节牙骨质稳态以及通过参与先天免疫防御来预防OIIRR的负责细胞群。因此，这些细胞在基础正畸研究中得到了深入研究，特别是关于它们对正畸压缩力或牙周病原体及其成分（如肽聚糖）的反应。

牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是一种革兰阴性厌氧菌，被认为是慢性牙周炎进展的关键病原体之一。牙龈卟啉单胞菌细胞壁的一个组成部分是肽聚糖（PGN）。牙龈卟啉单胞菌PGN是一种普遍存在的细菌成分，尽管它具有众所周知的强大促炎特性，但也可能在免疫防御反应中发挥作用。已知它可以刺激人牙龈角质形成细胞中丰富的PD-L1蛋白表达，但这尚未在成牙骨质细胞中得到证实。重要的是，牙周致病菌之一的牙龈卟啉单胞菌与正畸力（CF）相互作用的分子和细胞机制在成牙骨质细胞中尚不了解。

缺氧诱导的PD-L1表达已在多种原发性和各种癌细胞类型中发现。缺氧诱导转录因子（HIF）是正畸力转录反应的关键调节因子，据报道可调节成牙骨质细胞的凋亡过程。然而，目前尚不清楚HIF-1α是否调节成牙骨质细胞中 PD-L1 的表达。去年，德国尤斯图斯·李比希吉森大学医学院口腔正畸学系、牙周病学系的一项研究观察结果强调了理解PD-L1表达在成牙骨质细胞中如何调节的机制的重要性。

牙龈卟啉单胞菌 PGN 触发成牙骨质细胞中 PD-L1 的上调

首先，实验采用所有方法验证了不同浓度的牙龈卟啉单胞菌PGN感染后PD-L1在成牙骨质细胞中表达的动力学。结果发现，用牙龈卟啉单胞菌PGN刺激成牙骨质细胞导致PD-L1蛋白表达以浓度依赖性方式上调，在100 μg/mL时达到峰值。PD-L1的IF染色结果显示，牙龈卟啉单胞菌PGN（100 μg/mL）感染细胞中PD-L1的表达明显高于未受刺激细胞。RT-qPCR基因表达分析显示，100 μg/mL牙龈卟啉单胞菌PGN 刺激24 h后，PD-L1 mRNA水平明显高于孵育开始时间点（0）。

这些数据表明，牙龈卟啉单胞菌PGN以剂量和时间依赖性方式显著上调了成牙骨质细胞中的PD-L1分子表达，从4小时开始，在8小时后达到峰值，然后在12小时后衰减至48小时。

压缩力触发 OCCM-30 细胞中 PD-L1 和 HIF-1α 的表达

由于压缩是正畸诱导微环境的主要组成部分之一，因此，首次在永生化小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30上研究CF对免疫检查点之一的程序性死亡受体配体1（PD-L1）表达的影响。结果表明，载荷量为 2.4 gf/cm2 的CF在8、12和24小时内显著增加了PD-L1 在mRNA和蛋白质水平上的表达（图1 B、C）。同样，通过PD-L1的免疫荧光染色可见，CF组表达强烈上调（图1 D）。

进一步研究了CF是否可以诱导OCCM-30细胞中的HIF-1α表达。结果表明，CF显著增加了成牙骨质细胞中HIF-1α蛋白和基因的表达。还观察到HIF-1α在压缩细胞中含量丰富。

因此，这些结果表明，压缩力导致成牙骨质细胞中PD-L1轻微上调，促进了HIF-1α的表达。

图1 响应压缩力的OCCM-30细胞中PD-L1和HIF-1α的上调。

用正畸力（2.4 gf/cm2）压缩成牙骨质细胞培养物，在不同时间段（1，2，4，6，8，12和24小时）。（A）生理细胞培养条件和受压缩力（CF）刺激的细胞的照片。（B、C）通过免疫印迹法测定PD-L1蛋白表达，并通过IF染色检测其定位。（D）在指定时间点压缩力下培养的OCCM-30细胞中PD-L1基因表达的RT-qPCR定量。（E、F）通过蛋白质印迹法测定HIF-1α蛋白表达。采用IF法评估HIF-1α定位。（G）在指定时间压缩力下培养的OCCM-30细胞中HIF-1α基因表达的RT-qPCR定量。

压缩介导牙龈卟啉单胞菌PGN触发的PD-L1在成牙骨质细胞上的表达

WB分析显示，PD-L1在牙龈卟啉单胞菌PGN感染的成牙骨质细胞中表达上调（图2 A-D）。重要的是，特别是在与CF和牙龈卟啉单胞菌PGN共刺激24小时后，PD-L1蛋白表达增强。与对照组（7.19±0.60%）相比，牙龈卟啉单胞菌 PGN或CF也增加了坏死性凋亡的比例（分别为11.22±0.75%；14.79±1.84%）（图2 E、F）。牙龈卟啉单胞菌PGN联合CF显著增加成牙骨质细胞坏死性凋亡（39.55±4.51%）（图2 E、F）。这些结果表明，压缩力可以调节牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1表达并参与成牙骨质细胞的坏死性凋亡。

图2 压缩力以及牙龈卟啉单胞菌PGN触发PD-L1表达并参与坏死性凋亡调节。在存在或不存在压缩力（2.4 gf/cm2）的情况下，用确定浓度的牙龈卟啉单胞菌PGN（100 μg/ mL）处理成牙骨质细胞。（A-D）在存在或不存在CF的情况下，PD-L1在牙龈卟啉单胞菌PGN处理的细胞上表达水平的蛋白质印迹分析。（E、F）通过流式细胞术分析显示了膜联蛋白-V FITC和PI染色的代表性图。坏死性凋亡率（Annexin-V FITC+/PI+）显示在右上象限。图形显示了在存在或不存在压缩力的情况下，暴露于牙龈卟啉单胞菌PGN的坏死性凋亡细胞的百分比。

压缩作用下牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1和HIF-1α在成牙骨质细胞中的相关性

为了探讨牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1表达是否依赖于HIF-1α，使用了HIF-1α抑制剂IDF11774。WB结果表明，HIF-1α在压缩作用下的阻断显著消除了牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1蛋白上调（图3 A、B）。IF染色显示，在牙龈卟啉单胞菌PGN刺激下，抑制 HIF-1α对诱导性PD-L1表达具有显著抑制作用（图3 C）。此外，在与IDF11774共刺激24小时后，观察到细胞坏死性凋亡（图3 C、D）。在存在压缩力的情况下，IDF11774增加了坏死性凋亡细胞的百分比。牙龈卟啉单胞菌PGN加CF组坏死性凋亡细胞的百分比也有所增加（图3 E）。因此，这些证据表明，HIF-1α是压缩力下牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1 mRNA和蛋白质表达的主要调节因子。

图3 牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的PD-L1表达取决于OCCM-30细胞在压缩力下的HIF-1α信号。将OCCM-30细胞与不同浓度的HIF-1α抑制剂IDF11774预孵育2 h，然后分别用牙龈卟啉单胞菌PGN结合压缩力刺激24 h。

（A、B）响应IDF11774（20 uM）的PD-L1蛋白水平的蛋白质印迹分析。（C）代表性IF染色显示24小时后PD-L1在存在或不存在IDF11774的情况下在牙龈卟啉单胞菌PGN刺激的OCCM-30细胞中表达。（D、E）计算暴露于HIF抑制剂的坏死性凋亡细胞的百分比以及与牙龈卟啉单胞菌PGN和CF共同刺激的坏死性凋亡细胞的百分比。（F）OCCM-30细胞可以在体外释放可溶性GAS-6，如果HIF-1α被抑制剂阻断，这种作用就会受损。此外，牙龈卟啉单胞菌PGN诱导的GAS-6释放被HIF-1α阻断剂拮抗。

HIF-1α 通过减少 GAS-6 分泌参与成牙骨质细胞的免疫调节

据描述，可溶性GAS-6在PDL细胞的稳态中发挥免疫调节作用。因此，实验旨在分析OCCM-30细胞是否可以释放GAS-6，并且在存在或不存在HIF-1α抑制剂的情况下，通过与牙龈卟啉单胞菌PGN和/或CF的共同刺激是否可以改变其表达。结果表明，OCCM-30细胞具有释放GAS-6（27.67 ±11.15 pg/mL）的特性，并且该释放对IDF11774（18.04 ± 8.43 pg/mL）的使用无显著影响（图3 F）。用牙龈卟啉单胞菌PGN处理不会改变GAS-6的产生。有趣的是，在CF和CF加牙龈卟啉单胞菌PGN刺激条件下，IDF11774导致GAS-6的释放分别降低至10.72±1.82 pg/mL和19.33±8.84 pg/mL。因此，这些结果表明，GAS-6是成牙骨质细胞的免疫调节剂，可以通过HIF-1α被释放和调节。

图4 该方案描述了HIF-1α在成牙骨质细胞中的作用方式：牙龈卟啉单胞菌PGN刺激了成牙骨质细胞的PD-L1上调。压缩力诱导OCCM-30细胞表达HIF-1α和PD-L1。牙龈卟啉单胞菌PGN和压缩力的共刺激调节PD-L1表达，增加OCCM-30细胞坏死凋亡比。抑制HIF-1α可抑制PD-L1表达以及可溶性GAS-6的产生。因此，HIF-1α在压缩力作用下调节成牙骨质细胞中PGN-诱导的PD-L1表达中起重要作用。

基于体外小鼠成牙骨质细胞模型，该研究表明，牙龈卟啉单胞菌PGN上调了成牙骨质细胞的PD-L1，并且这种效果通过HIF-1α响应压缩力而维持。激活HIF-1α调节成牙骨质细胞的坏死性凋亡。阻断HIF-1α可通过减少GAS-6释放来消除成牙骨质细胞的免疫反应。

该数据首次表明，在正畸诱导的微环境下，免疫检查点PD-L1与HIF-1α在成牙骨质细胞免疫抑制中相关。此外，通过使用HIF-1α和PD-L1靶向抑制，在OTM期间对牙周炎个体进行OIIRR的免疫治疗可能有助于免疫反应。

参考文献：Yong J, Gröger S, Meyle J, Ruf S. Immunorthodontics: Role of HIF-1α in the Regulation of (Peptidoglycan-Induced) PD-L1 Expression in Cementoblasts under Compressive Force. Int J Mol Sci. 2022 Jun 23;23(13):6977. doi: 10.3390/ijms23136977. PMID: 35805974; PMCID: PMC9266671.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35805974/

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