振荡剪切应力诱导的EPCs外泌体circ_1199在EPCs间质转化及病理性血管重构中的作用及机制

振荡剪切应力诱导的EPCs外泌体circ_1199在EPCs间质转化及病理性血管重构中的作用及机制

研究表明,内皮-间充质转化(EndoMT)参与病理性血管重塑过程。作为内皮细胞的前体细胞,内皮祖细胞(EPCs)EndoMT也是病理性血管重塑的常见机制。此外,振荡剪切应力(OSS)促进了EPC EndoMT。EPCs暴露于OSS后,内皮细胞标志物VE-钙粘蛋白和CD31的表达下调。同时,间充质细胞标志物α-SMA和SM22α的表达显著增加。因此,潍坊医学院基础医学院、淄博市中心医院转化医学中心的一项研究探讨了OSS诱导的EPC EndoMT的机制,以期进一步阐明OSS对EPC EndoMT的影响以及病理性血管重塑的发生和发展。


外泌体(Exos)是具有完整膜结构(直径30-150nm)的纳米级细胞外囊泡,主要负责细胞间的物质运输和信息传递。Exos被认为是细胞-细胞通讯的重要介质,参与许多生理和病理过程。在这项研究中,研究人员发现OSS处理的EPCs释放的Exos(OSS-Exos)可以诱导EPC EndoMT。但内部机制有待进一步探讨。


最近,Exos中的环形RNAs(circRNAs)引起了广泛的关注。CircRNAs具有共价闭环结构。新出现的证据表明,外泌体circRNAs在复杂的人类病理学中起着重要作用。此外,circRNAs可以充当miRNA分子的“海绵”,抑制miRNA与靶基因mRNAs的结合,从而促进靶基因的转录。


该团队使用高通量测序技术研究了暴露于OSS的EPCs中circRNAs的表达谱。基于生物信息学分析和实验验证,发现circ-1199被OSS显著上调并明显加载到Exos中。然而,OSS诱导的EPC EndoMT是否由外泌体circ-1199介导目前尚不清楚。该研究旨在探讨 Exos 和外泌体circ-1199对EPC EndoMT的影响和可能机制。


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从 OSS 处理的 EPCs 灌流液中分离的Exos诱导 EPC EndoMT


EPCs分泌的Exos影响血管细胞和组织功能,实验首先确定了Exos是否参与OSS(±3.5 dyne/cm2,1 Hz)诱导的EPC EndoMT。从细胞上清液(Static-Exos)或灌流液(OSS-Exos)中分离Exos。WB揭示了EPCs衍生的Exos表达CD9、CD81和CD63,它们是Exos的代表标志物。


为了评估OSS-Exos对EPC的影响,PKH26标记的Exos与EPCs的共培养,发现这些Exos被EPCs有效地吸收(图1 D)。EdU测定结果表明,OSS-Exos显著增加了EPCs的增殖(图1 E)。RT-qPCR和WB结果显示,OSS-Exos下调内皮标志物CD31和VE-钙粘蛋白的表达,上调间充质细胞标志物α-SMA和SM22α的表达(图1 F、G)。这些数据表明,OSS-Exos在EPCs中诱导了EndoMT。


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图1 OSS-Exos诱导EPC增殖和EndoMT。



Circ-1199 在用 OSS 和 OSS-Exos 处理的 EPCs 中显著上调


通过高通量RNA测序筛选用OSS处理的EPCs中表达的circRNAs。如图2 A-B所示,基于生物信息学分析,选择circ-1199作为靶向circRNA。接下来,通过RT-qPCR证实了circ-1199在OSS 加载的EPCs中的表达。结果表明,当EPCs加载OSS持续 3、6、12、24 h时,circ-1199在6 h后增加,并在24 h内保持较高水平(图2 C)。此外,RNA FISH表明EPCs在静态状态下很少表达circ-1199,但在OSS加载后circ-1199阳性细胞数量明显增加(图2 D)。


接下来,进行RT-qPCR和RNA FISH测定以测量Exos中circ-1199的表达。RT-qPCR结果显示,OSS-Exos中circ-1199的水平高于静态-Exos(图2 E)。RNA FISH结果表明,当Exos与EPCs共培养时,OSS-Exos处理的EPCs中circ-1199的表达高于静态-Exos处理的EPCs(图2 F)。


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图2 Circ-1199在用OSS处理的EPC中异常表达。



Circ-1199 促进了 EPC EndoMT


为了评估circ-1199对EPC EndoMT的影响,将circ-1199过表达慢病毒载体(LV-circ-1199)转染到EPCs中。结果表明,用LV-circ-1199转染EPCs后,circ-1199的表达明显上调,增殖明显增加。此外,内皮细胞标志物VE-钙粘蛋白和CD31的表达降低,而间充质标志物α-SMA和SM22α的表达在基因和蛋白质水平均上调。这些结果与用OSS-Exos处理的EPCs的结果一致。



Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA 参与 EPC EndoMT


新兴研究表明,circRNAs的主要机制是作为miRNA的海绵,从而释放miRNAs对靶基因的抑制作用。然后,实验预测了miRNAs和circRNAs之间的结合位点。结果表明,circ-1199具有两种类型的miRNAs(miR-520f和let-7g-5p)的结合位点,let-7g-5p表现出更多的结合位点。同时,获得了94个靶基因作为let-7g-5p候选基因,其中HMGA2得分最高。双荧光素酶报告基因测定显示,circ-1199有效结合let-7g-5p(图3 C),let-7g-5p也与HMGA2 mRNA的3′UTR结合(图3 D)。RT-qPCR结果表明,circ-1199的过表达降低了let-7g-5p的表达,同时增加了HMGA2的表达(图3 E)。此外,let-7g-5p模拟物(图3 F)和LV-shHMGA2(图3 G)都下调了EPCs中α-SMA和SM22α的表达。


有趣的是,用OSS-Exos处理EPCs后,circ-1199的表达增加(图3 H)。同时,let-7g-5p的表达降低(图3 I),HMGA2显著增加(图3 J)。WB结果证实了HMGA2的上调表达(图3 K)。


这些结果表明,OSS-Exos可以上调circ-1199,从而可能发挥分子“海绵”的作用吸附let-7g-5p,从而增加HMGA2的表达。


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图3 Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA参与EPC EndoMT。



Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 调节 EPC 转录因子 Smad3 和 Snail


据报道,多种信号通路,如TGF-β/Smad信号、Wnt/β-连环蛋白信号和Notch信号通路,都参与了EndoMT的转录调控。研究表明,HMGA2上调TGF-β/Smad信号通路中Snail、Twist 和Slug 的表达,从而导致上皮细胞中上皮到间充质的转化(EMT)。因此,实验进一步研究了转录因子Smad3和Snail是否参与EPCs的EndoMT过程。WB结果表明,OSS-Exos处理EPCs后,p-Smad3/Smad3和Snail的蛋白表达明显上调。


为了进一步了解OSS-Exos激活EPCs中EndoMT相关转录因子的机制,在用LV-circ-1199,let-7g-5p模拟物或LV-shHMGA2预处理EPCs后测量了HMGA2,p-Smad3 / Smad3和Snail的表达。结果表明,经LV-circ-1199、let-7g-5p模拟物和LV-shHMGA2处理后,HMGA2、p-Smad3/Smad3和Snail 的表达均上调。然而,let-7g-5p模拟物和LV-shHMGA2抑制了EPCs中HMGA2,p-Smad3/Smad3和Snail的表达。


这些结果表明,circ-1199–let-7g-5p–HMGA2参与了EPCs中OSS-Exos诱导的p-Smad3/Smad3和 Snail 的激活。



OSS-Exos 和 circ-1199 在体外和体内都损伤了 EPCs 的血管生成


血管生成能力是EPCs的重要功能。血管生成能力下降是 EPC s中 EndoMT 之后的标志性事件。为了进一步研究OSS-Exos对EPC功能的影响,实验在体外评估了血管生成。结果表明,OSS-Exos组EPC血管生成显著降低(图4 A)。此外,用LV-circ-1199转染后,EPCs的血管生成能力也明显降低(图4 B)。


接下来,使用Matrigel plug 测定法来测定小鼠体内EPCs的血管生成。结果表明,用OSS-Exos处理的EPCs形成较少的血管样结构(图4 C)。此外,在OSS-Exos处理的EPCs中,CD31和vWF的表达降低(图4 D),α-SMA和SM22α的表达增加(图4 E)。


此外,与对照组相比,用LV-circ-1199处理EPCs后,血管状结构的数量减少(图4 F)。同时,内皮标志物CD31和vWF的表达降低(图4 G),但间充质标志物α-SMA和SM22α的表达明显增加(图4 H)。


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图4 OSS-Exos和circ-1199在体外和体内都损害了EPCs的血管生成。


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图5 在Exos circ-1199处理后 EPC EndoMT的机制。


综上所述,在OSS-Exos中富集的circ-1199促进EPC EndoMT并作为let-7g-5p的分子海绵,从而上调HMGA2的表达。然后p-Smad3/Smad3/Snail 可能参与这个过程(图5)。




参考文献:Li L, Wen J, Li H, He Y, Cui X, Zhang X, Guan X, Li Z, Cheng M. Exosomal circ-1199 derived from EPCs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of EPCs by increasing HMGA2 expression. Life Sci. 2023 Jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. Epub 2022 Nov 23. PMID: 36435223.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36435223/


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