机械拉伸诱导的腱调蛋白表达通过F-肌动蛋白和染色质重塑促进肌腱细胞迁移

肌腱是机械敏感组织，具有高度组织的胶原蛋白结构，连接肌肉和骨骼，并在运动过程中充当力传递器。肌腱细胞是肌腱的主要功能细胞，嵌入胶原纤维束中，通过感知和响应生物力学信号，负责维持肌腱稳态和生物力学特性。

Tenomodulin（Tnmd，腱调蛋白）是一种II型跨膜糖蛋白，已被确定为肌腱成熟特异分子标志，在干细胞/祖细胞（TSPC）增殖、分化和衰老中起重要作用。Tnmd缺失的TSPCs也被证明表现出严重的迁移缺陷。此外，Tnmd已被确定为在发育和成年肌腱中诱导的机械敏感基因，其在肌腱中的表达与力强度相关。

细胞质中生物力学信号的感知和翻译高度依赖于细胞骨架。特别是，肌动蛋白细胞骨架在对机械刺激产生协调和定向的细胞反应中起着机械调节作用。此外，有研究表明，肌动蛋白细胞骨架介导的染色质组织参与了力诱导的转录，但该通路是否参与调节生物力学诱导的Tnmd表达还有待证明。

重庆大学生物流变科学与技术教育部重点实验室、重庆邮电大学生物信息学院的一项研究探讨了循环机械拉伸对Tnmd表达的影响，揭示了Tnmd在拉伸诱导的肌腱细胞迁移中的作用。此外还探索了导致Tnmd表达和肌腱细胞迁移的潜在机械转导机制，重点是肌动蛋白细胞骨架介导的染色质组织。

机械拉伸诱导肌腱细胞中 Tnmd 表达和细胞迁移

为了确认Tnmd在肌腱组织和细胞中的表达，对Tnmd进行mRNA和蛋白质分析，与肌腱组织相比，培养的肌腱细胞中的Tnmd显著降低（图1 A、B）。接下来，分析Tnmd在加载单轴循环拉伸（10%，0.5Hz，1小时）的肌腱细胞中的基因和蛋白表达。结果表明，与未拉伸的肌腱细胞相比，Tnmd在mRNA（图1 C）和蛋白质（图1 D、E）处的表达水平较高。此外，检测机械拉伸下肌腱细胞的迁移行为。数据显示，负载的肌腱细胞迁移显著增加（图1 F、G）。这些结果可推断机械拉伸诱导的Tnmd表达与肌腱细胞迁移之间可能存在关联。

图1 拉伸上调培养的肌腱细胞中Tnmd表达和细胞迁移。

（A）RT-qPCR检测Tnmd mRNA表达水平。（B）免疫印迹检测肌腱组织和培养肌腱细胞中Tnmd蛋白水平。（C-E）分别采用RT-qPCR、WB和免疫荧光分析Tnmd在拉伸的肌腱细胞中的基因和蛋白表达。（F）测定迁移性肌腱细胞。（G）对迁移率进行了量化。

拉伸增加的 Tnmd 调节肌腱细胞的迁移

为了进一步研究Tnmd是否可以直接调节肌腱细胞迁移，实验利用sh-RNA 敲低Tnmd后测定肌腱细胞的迁移能力。与对照沉默组（pLKO.1）相比，Tnmd敲低组（sh-Tnmd1和sh-Tnmd2）Tnmd的mRNA和蛋白显著降低（图2 A、B）。此外，拉伸刺激的肌腱细胞组表现出比机械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱细胞组更高的Tnmd表达（图2 C、D）。而且暴露于机械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱细胞组中肌腱细胞的迁移也显著减少（图2 E、F）。这些发现表明，肌腱细胞将机械力转化为促进肌腱细胞迁移的Tnmd信号。

图2 拉伸通过增加的Tnmd表达来增强肌腱细胞迁移。

（A、B）RT-qPCR 和 WB 检测 Tnmd mRNA 和蛋白质表达。肌腱细胞被表示为“pLKO.1”，并感染慢病毒-shcontrol。肌腱细胞被表示为“sh-Tnmd”并干扰靶向Tnmd的慢病毒。使用两个独立的Tnmd shRNA，分别表示为sh-Tnmd1和sh-Tnmd2。（C、D）通过WB检测Tnmd和GAPDH（拉伸对照）的蛋白表达。（E）检测迁移性肌腱细胞。（F）对迁移进行计数和量化。

拉伸增强的肌动蛋白应力纤维增加 Tnmd 表达和肌腱细胞迁移

肌动蛋白细胞骨架对于细胞内的快速机械信号传递至关重要。为了探索肌动蛋白细胞骨架在拉伸诱导的Tnmd和肌腱细胞迁移中的可能作用，实验评估了机械拉伸对F-肌动蛋白细胞骨架组织的响应。与未拉伸组相比，拉伸的肌腱细胞表现出增厚的肌动蛋白应力纤维（图3 A、B）。为进一步研究肌动蛋白应力纤维对拉伸诱导的Tnmd表达和肌腱细胞迁移的影响，用抑制肌动蛋白聚集药物Lat A（0.5 μM）预孵育后检测Tnmd表达和肌腱细胞迁移，Lat A 可以有效破坏肌动蛋白应力纤维的形成（图3 C、D）。结果发现，与没有Lat A的拉伸肌腱细胞相比，在Lat A存在下暴露于拉伸的肌腱细胞表现出较低的Tnmd表达。此外，在受拉伸的细胞中，肌腱细胞迁移增加，而在Lat A存在下拉伸的细胞显示肌腱细胞迁移显著减少（图3 F、G）。

此外，考虑到Rho 相关的卷曲蛋白激酶（ROCK）是肌动蛋白应力纤维的特异性因子，因此评估了ROCK抑制剂Y27632对拉伸增加的Tnmd表达和肌腱细胞迁移的影响。结果表明，使用Y27632抑制肌动蛋白应力纤维可消除拉伸诱导的Tnmd表达和肌腱细胞迁移。这些结果表明，肌动蛋白应力纤维对于诱导拉伸细胞中的Tnmd表达和肌腱细胞迁移很重要。

图3 肌动蛋白应力纤维的增厚有助于拉伸肌腱细胞中的Tnmd表达和肌腱细胞迁移。

（A、C）通过鬼笔环肽染色检测F-肌动蛋白组织，用DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。右列是左侧原始图像绿色边框的部分放大视图。（B、D）用应力纤维增厚（SFTI）评估和量化F-肌动蛋白细胞骨架重塑。（E）WB用于分析Tnmd蛋白的表达。（F）检测迁移性肌腱细胞。（G）对迁移进行计数和量化。

拉伸诱导的染色质解聚增加 Tnmd 表达和肌腱细胞迁移

为了确定染色质组织是否由机械刺激介导，实验评估了拉伸细胞中染色质凝聚的状态。DNase I 敏感位点（DHS）具有可接近染色质特征。结果表明，在没有DNase I（脱氧核糖核酸酶I）的情况下进行拉伸的细胞的核区域与未拉伸组的细胞核区域没有区别（图4 A、B）。然而，DNase I处理导致拉伸细胞中的核面积比未拉伸的细胞小（图4 A、B），表明机械拉伸导致染色质解聚。

接下来，确定了染色质解聚是否与拉伸诱导的Tnmd表达和迁移有关。两种特异性药物组蛋白乙酰转移酶抑制剂（ANA）和去甲基化酶抑制剂（GSK-J4）用于抑制染色质解聚。结果表明，与没有抑制剂的拉伸细胞相比，ANA或GSK-J4处理的拉伸肌腱细胞中染色质凝聚增加（图4 C、D）。

为了确定处于凝缩状态的染色质对拉伸诱导的Tnmd表达和肌腱细胞迁移的影响，将肌腱细胞与ANA或GSK-J4预孵育1 h，然后用拉伸刺激。结果表明，在染色质解聚抑制剂ANA和GSK-J4存在下暴露于拉伸的肌腱细胞在mRNA水平上Tnmd的表达较低（图4 E）。此外发现，与拉伸的肌腱细胞相比，在ANA处理的拉伸细胞或GSK-J4处理的拉伸细胞中，Tnmd蛋白表达和肌腱细胞迁移被消除（图4 F-H）。这些结果表明，组蛋白甲基化和乙酰化引起的染色质解聚可能有助于拉伸诱导的Tnmd表达和肌腱细胞迁移。

图4 解凝染色质有助于拉伸肌腱细胞中的Tnmd表达和腱细胞迁移。

（A、C）通过原位DNase I灵敏度检测染色质凝聚。（B、D）用核面积评估和量化染色质凝聚的程度。（E）Tnmd mRNA表达的RT-qPCR检测。（F）WB用于分析Tnmd蛋白的表达。（G）检测迁移性肌腱细胞。（H）对迁移进行计数和量化。

总之，该研究结果表明，肌动蛋白应力纤维的形成和染色质解聚可调节Tnmd表达，从而可能调节肌腱细胞迁移。因此，该研究提出了肌动蛋白和染色质机械转导通路参与Tnmd调控，并揭示了Tnmd在肌腱细胞迁移中的新作用。Tnmd在肌腱细胞迁移中的功能鉴定为Tnmd介导的肌腱修复所涉及的分子机制提供了见解。

参考文献：Xu P, Deng B, Zhang B, Luo Q, Song G. Stretch-Induced Tenomodulin Expression Promotes Tenocyte Migration via F-Actin and Chromatin Remodeling. Int J Mol Sci. 2021 May 6;22(9):4928. doi: 10.3390/ijms22094928. PMID: 34066472; PMCID: PMC8124537.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34066472/

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