流体剪切应力通过膜联蛋白A6介导的自噬调节MC3T3-E1细胞成骨分化

机械力学信号对骨量调节、骨稳态和骨骼适应有深远影响。通常，机械力传递到骨组织，并由机械敏感细胞（骨细胞、成骨细胞、破骨细胞及其祖细胞）感知，通过细胞增殖、分化和凋亡导致成骨。许多体外研究证实，成骨细胞对各种不同的剪切应力（FSS）都有敏感反应，其中最常用的范围为 0.5-2Pa。迄今为止，FSS对骨重塑的影响已受到广泛关注，但对其潜在的分子机制知之甚少，例如FSS如何与其他过程（包括自噬）整合，从而极大地促进骨重塑以刺激成骨细胞的分化。

膜联蛋白A（AnxA）是一个钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，参与细胞膜的组成、胞吞、胞吐、离子通道调节、离子通道活性、细胞信号转导及细胞膜与细胞骨架的连接等。研究表明，成骨细胞和平滑肌细胞中AnxA6的异常表达会导致一些病理过程，例如骨质疏松症和动脉粥样硬化。此外，AnxA6通过调节囊泡脂膜的形成和促进细胞胞吐作用来促进自噬过程。膜联蛋白在细胞中的表达和分布对机械微环境的变化高度敏感，尤其是流体流动，而AnxA6在FSS介导的成骨细胞矿化中的作用尚不清楚。

鉴于自噬在成骨细胞增殖和分化中的作用，以及AnxA6参与自噬过程，在四川华西基础医学与法医学院生物医学工程研究室的一项研究中，阐明了AnxA6调节的自噬在FSS介导的成骨细胞分化中的作用。

FSS 诱导成骨细胞分化

为了研究FSS对骨形成的影响，首先探讨了FSS如何影响机械力学敏感细胞MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞前体细胞系）的成骨分化。不同强度的FSS，分别为 0（静态对照）、5、10 和 20 dyn/cm2，应用于MC3T3-E1细胞1h。结果显示，与对照组相比，FSS显著促进成骨标志物 Col I 和 ALP 的表达（图1 A、B）。随着FSS强度的增加，Col I表达上调，在20 dyn/cm2 组中观察到最高表达，而ALP的表达在10 dyn/cm2 的条件下最高。

为了优化FSS对成骨细胞分化的影响，在FSS强度为10 dyn/cm2 的情况下，对 MC3T3-E1细胞施加0（静态对照）、0.5、1、2、4 h不同的加载时间。结果显示，10 dyn/cm2 FSS的强度引起成骨分化相关基因Runx2、ALP和Col I的表达，在1 h 后增加到最高水平（图1 C、D）。此外，分别对MC3T3-E1细胞进行ALP染色和ALP活性监测，以进一步探讨FSS对成骨分化的影响。如图1 E、F，与静态组相比，暴露于10 dyn/cm2 1 h 时ALP阳性细胞增加了1.8倍。ALP活性也表现出3.6倍的显著增强（图1 G）。

这些结果表明，10 dyn/cm2 强度的FSS 持续 1 h有利于MC3T3-E1细胞的成骨分化。

图1 FSS诱导成骨细胞分化。

FSS 促进 MC3T3-E1 细胞中 AnxA6 的表达

为了研究AnxA6对FSS的响应，对 MC3T3-E1 细胞施加0，5，10和20 dyn/cm2 的FSS 1 h。通过蛋白质印迹测定，AnxA6在5和10 dyn/cm2下表达显著升高，但暴露于 20 dyn/cm2 时明显下降（图2 A、B）。

为进一步探讨FSS加载持续时间对AnxA6表达的影响，在强度为10 dyn/cm2 下的MC3T3-E1细胞上应用0、0.5、1、2和4 h的不同加载时间的FSS。与静态组相比，FSS处理1 h后AnxA6升高至最高水平，而在处理0.5和4 h后，AnxA6表达下降（图2 C、D）。MC3T3-E1细胞用10 dyn/cm2 的FSS 处理1h后，AnxA6的免疫荧光强度升高（图2 E）。

这些结果表明，10 dyn/cm2 强度的FSS持续1 h 可以促进AnxA6的表达，这与图1 中Runx2、ALP和Col I的表达一致，表明AnxA6表达与成骨分化之间存在潜在相关性。

图2 FSS促进MC3T3-E1细胞中AnxA6的表达和易位。

AnxA6 参与 FSS 诱导的成骨分化

通过构建稳定的AnxA6敲低的MC3T3-E1细胞系，研究AnxA6对成骨细胞分化的影响。在MC3T3-E1细胞中，AnxA6的缺乏导致矿物沉积减少，ALP阳性细胞减少，ALP活性降低。成骨相关蛋白ALP和Col I表达的降低进一步证实了AnxA6缺失对成骨分化的抑制。为了进一步探索AnxA6在FSS调节的成骨中的作用，对shCtrl和shAnxA6 MC3T3-E1细胞施加1 h 10 dyn/cm2 的 FSS，结果表明，当暴露于10 dyn/cm2的FSS 1h时，shAnxA6细胞中ALP和Col I的表达恢复到较高水平，但在相同的FSS负荷下，仍然不能超过shCtrl细胞中的水平。

敲低 AnxA6 在 FSS 条件下损害自噬

接下来探讨了FSS诱导的AnxA6是否会影响自噬。与静态组相比，暴露于5、10和20 dyn/cm2 的细胞自噬标志物Beclin1、ATG5和ATG7表达较高，并伴有较多的LC3B-I转化产生大量的LC3B-II，表明自噬流发生加速。

通过调节FSS持续时间进一步研究了FSS加载时间对自噬的影响。与静态对照相比，10 dyn/cm2 FSS持续0.5和1 h后MC3T3-E1中Beclin1、ATG5和ATG7的表达增加，而自溶酶体中可被降解破坏的p62显著降低。这些结果表明，10 dyn/cm2 强度的FSS持续1 h 可导致自噬的显著发生。

为了揭示AnxA6在FSS诱导的自噬中的作用，应用1h 10 dyn/cm2的FSS 到 shCtrl 和 shAnxA6 MC3T3-E1 细胞。实验发现，无论FSS负荷如何，在shCtrl组中，Beclin1和ATG5在FSS中显著增加，而其在AnxA6敲低细胞中受到极大抑制（图3 A、B）。透射电子显微镜（TEM）的结果与上述蛋白质印迹分析呈现相似的趋势（图3 C）。在shCtrl细胞中通过FSS诱导形成更多的自噬体，而AnxA6敲低细胞显示出自噬体的数量减少。此外，暴露于FSS时细胞质中有更多的LC3B点状分布，表明自噬流的发生，尽管敲低AnxA6组阻碍了该过程（图3 D）。

这些结果表明，FSS可以通过诱导AnxA6诱导自噬的发生。

图3 敲低AnxA6会损害FSS诱导的自噬。

FSS 通过激活 AnxA6 介导的自噬来促进成骨分化

为了进一步剖析自噬在成骨分化和基质矿化中的作用，实验在体外矿化过程中使用自噬抑制剂（氯喹）和自噬激活剂（雷帕霉素）调控自噬状态。用成骨培养基培养MC3T3-E1细胞7或14天后，氯喹对自噬的抑制大大减少了ALP阳性染色细胞的数量，并抑制了矿化结节的形成，而雷帕霉素激活自噬显示出完全相反的效果，促进了矿化过程（图4 A、B）。此外，氯喹的添加降低了MC3T3-E1细胞中Beclin1和ATG7的表达，以及ALP和Col I的表达。另一方面，雷帕霉素上调自噬和成骨细胞分化相关蛋白表达（图4 C、D）。这些结果表明，自噬调节引起了成骨细胞分化和矿化的改变。

最后实验研究了FSS诱导的AnxA6是否通过激活自噬来增强成骨细胞分化。由于敲低AnxA6在静态和FSS条件下均导致自噬和成骨分化的抑制，因此雷帕霉素用于恢复AnxA6敲低抑制的自噬流，并随后检测成骨标志物的表达，以确定自噬在此过程中的影响。如图4 E、F，雷帕霉素的前提条件恢复了在shAnxA6组中受到抑制的ALP和Col I的表达，特别是在FSS负荷条件下。此外，ALP和Col I的表达与自噬标志物（包括Beclin1、ATG5和ATG7）的表达呈正相关。

总体而言，FSS通过AnxA6介导的自噬激活有助于成骨细胞的分化和矿化。

图4 FSS通过激活AnxA6介导的自噬来促进成骨分化。

图5 FSS通过膜联蛋白A6介导的自噬促进成骨细胞分化。

MC3T3-E1细胞对外部机械力学刺激敏感。一旦FSS施加在MC3T3-E1细胞上，AnxA6就可以直接或与其他机械传感器协同响应FSS，伴随着其从细胞质到细胞膜的易位。随后，AnxA6表达升高影响下游自噬流，并进一步调节成骨分化。

总之，该研究结果表明，AnxA6调节的自噬在FSS诱导的成骨分化中起重要作用。实验发现 1 h 10 dyn/cm2 的FSS可提供足量的AnxA6来启动自噬并增加ALP和Col I表达，导致成骨分化。AnxA6的敲低强烈抑制自噬，从而降低了成骨分化，而自噬激活剂恢复的自噬流也可恢复FSS对成骨分化的影响。所有这些结果为FSS诱导的成骨机制提供了新的见解。

参考文献：Pei T, Su G, Yang J, Gao W, Yang X, Zhang Y, Ren J, Shen Y, Liu X. Fluid Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation via AnnexinA6-Mediated Autophagy in MC3T3-E1 Cells. Int J Mol Sci. 2022 Dec 11;23(24):15702. doi: 10.3390/ijms232415702. PMID: 36555344; PMCID: PMC9779398.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36555344/

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