机械应力通过TRPV4调节骨重塑过程中的牙周膜干细胞特征

牙周膜（PDL）是位于牙根与牙槽骨间的致密结缔组织，具有固定牙根和缓解咀嚼时所产生压力的作用。它在维持组织稳态方面起重要作用，并为机械刺激下的炎症反应和骨重塑提供微环境。牙周韧带干细胞（PDLSCs）作为PDL微环境中的主要间充质干细胞，表现出克隆形成能力、增殖性、多向分化和免疫调节特性。它们通过产生高水平的炎性细胞因子和趋化因子来响应机械应力，这些细胞因子和趋化因子在牙槽骨改建中起着至关重要的作用。然而，PDLSCs感知机械刺激并将其转化为生物信号，从而促进牙槽骨改建的机制仍有待进一步研究。

瞬时受体电位（TRP）通道是典型的机械敏感通道，在各种类型的组织和细胞中感受细胞内外各种刺激。瞬时受体电位香草素受体 4 型通道蛋白（TRPV4）能被多种理化刺激激活，调节机械感觉，炎症和能量稳态。从TRPV4敲除小鼠中分离出的间充质干细胞被发现成骨潜能受损。因此，有研究假设PDLSCs的干细胞特性受到机械刺激下TRPV4激活的影响，从而促进牙槽骨改建并最终影响牙齿移动。

口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室、北京大学口腔医院的一项研究曾使用机械力诱导的牙齿移动和体外压缩力刺激的动物模型，评估了PDLSCs在机械刺激下的生物学变化，包括其克隆性，增殖，多向分化和免疫调节特性，证明了PDLSCs中TRPV4的普遍上调及其在机械力作用下的潜在分子机制。这些结果共同阐明了机械应力诱导的TRPV4在调节PDLSCs干细胞特征和介导骨重塑方面的重要性。

机械应力在骨重塑和牙齿移动过程中诱导PDLSCs的增殖和炎症因子的表达

实验首先建立机械负荷牙齿移动实验动物模型（图1 A）。双重免疫染色显示，大多数Ki67阳性细胞（表明细胞增殖）与牙周组织中的CD146（MSCs的表面标志物）共定位。在施加应力后第3天，CD146 Ki67 PDLSCs的比例增加到5.1±1.9%，在第7天达到10.4±2.8%，表明机械应力刺激后PDLSCs的增殖能力增强（图1 B）。TRAP阳性破骨细胞在机械负荷期间积聚在牙槽骨附近的牙周组织中聚集（图1 C）。此外，机械应力后，促炎细胞因子IL-6和IL-1β的水平在牙周组织的压力侧增加（图1 D）。因此，机械应力促进PDLSC在体内增殖，这可能是促炎因子积累和牙周组织周围破骨细胞分化的原因。

图1 牙周膜干细胞（PDLSCs）和破骨细胞在体内施加机械力后积聚在牙周组织的压力侧。

机械应力改变了 rPDLSCs 的 MSC 特性

尽管据报道PDLSCs具有自我更新和多向分化潜力，但它们在骨重塑过程中机械刺激下的详细特征仍有待阐明。该研究分离了有或没有机械加载的rPDLSCs，并应用了多种实验技术对其进行表征。

CCK-8检测显示，力刺激的rPDLSCs（F-PDLSCs）的增殖强于正常PDLSCs（N-PDLSC），这与体内现象一致（图2 A）。两种细胞类型从0-3天缓慢增殖。然而，从3-7天，F-PDLSCs比N-PDLSCs生长得更快。 此外，与N-PDLSCs相比，F-PDLSCs显示出更强的集落形成能力（图2 B）。然后评估了它们的多向分化能力，结果表明，N-PDLSCs产生的矿化结节（用茜素红S染色）明显多于F-PDLSCs（图2 C）。定量分析表明，F-PDLSCs中脂质特异性油红O阳性细胞的数量少于N-PDLSCs（图2 D）。这些数据表明，rPDLSCs在体内机械刺激后表现出更大的增殖和降低的分化能力。

为了评估rPDLSCs的免疫调节功能，用F-PDLSCs或N-PDLSCs和RAW264.7巨噬细胞进行了Transwell迁移测定。结果发现，与N-PDLSC组相比，来自F-PDLSCs的条件培养基明显促进了巨噬细胞的迁移（图2 E）。然后通过与rPDLSC和RAW264.7巨噬细胞的细胞间接触共培养系统进一步评估了旁分泌对F-PDLSCs破骨细胞分化的影响。TRAP染色显示，与N-PDLSC组相比，F-PDLSCs增强了破骨细胞分化（图2 F）。此外，还评估了体外分离的rPDLSCs中促炎因子的表达。在F-PDLSCs中，IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA水平升高（图2 G）。此外，机械加载后Ki67蛋白水平上调，进一步证实了CCK-8测定的结果（图2 H）。

这些结果共同表明，F-PDLSCs的积极旁分泌作用，包括巨噬细胞迁移和诱导破骨细胞分化，可能归因于F-PDLSCs中促炎因子表达增强。总之，体内的机械刺激可能会改变rPDLSCs的MSC特征，从而有助于骨重塑和牙齿移动。

图2 体外力诱导的rPDLSCs的生物学特性。

TRPV4 通道在力刺激的 rPDLSCs 中被激活

接下来，实验确定了rPDLSCs如何感知机械力并将其转化为生物信号。先前的研究表明，TRPV通道对微环境温度，机械和化学刺激敏感。因此检测了rPDLSCs中TRPV通道的mRNA水平。在rPDLSCs中检测到TRPV1-4的mRNA表达，而F-PDLSCs中检测到TRPV4的mRNA表达增加（图3 A）。F-PDLSCs中的TRPV4蛋白水平也约为N-PDLSCs的四倍，与mRNA水平一致（图3 B）。

为了确认体内机械负荷后TRPV4表达增加，在机械力介导的牙齿移动过程中对TRPV4和CD146进行了双重免疫染色。加载力后，CD146TRPV4 PDLSCs的比例在第3天增加到3.9±0.9%，第7天增加到7.3±1.3%（图3 C）。这些结果表明，TRPV4作为机械力传感器，在机械刺激后在PDLSCs中被激活，这可能将机械刺激的转导与随后的生物反应联系起来。

图3 TRPV4存在于体外F-PDLSCs中。

抑制 TRPV4 可抑制力刺激的 rPDLSCs 的生物学特性

为了探究TRPV4是否参与在机械力作用下调节PDLSC功能，应用TRPV4 小分子拮抗剂GSK2193874在功能上确认其对F-PDLSCs的影响。 CCK-8 测定表明，GSK219 在 10 μmol/L 浓度下抑制了 F-PDLSCs 增殖速率的增强（图4 A）。GSK219处理也降低了F-PDLSCs的集落形成能力（图4 B）。此外，用GSK219处理后，F-PDLSCs和单核细胞共培养中的TRAP破骨细胞分化显著下降（图4 C）。免疫荧光染色显示，GSK219处理抑制了F-PDLSCs中IL-6的表达（图4 D）。此外，GSK219处理后，F-PDLSCs的IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA水平降低（图4 E）。这些结果共同表明，力诱导的TRPV4参与调节F-PDLSCs的增殖能力和集落形成能力，并通过分泌炎症相关基因介导旁分泌效应对破骨细胞分化的影响。

图4 抑制TRPV4抑制了体外F-PDLSCs的生物学特性。

hPDLSCs 中TRPV4 在体外机械力下调节NF-κB 配体/骨保护素比值

TRPV4在牙齿移动过程中的骨重塑过程中被激活，并调节力诱导的PDLSCs生物学特性。 因此，实验评估了PDLSCs中TRPV4表达在体外机械力下调节破骨形成的机制。静态压缩力（0-1.5 g/cm2，12 小时）处理的hPDLSCs显示TRPV4蛋白水平呈剂量依赖性增加。hPDLSCs中IL-6和TNF-α的mRNA水平在体外压缩力加载后上调，并由GSK219下调（图5 A）。蛋白质印迹结果一致显示，体外压缩力加载后Ki67蛋白水平上调，并由GSK219下调（图5 B）。此外，通过蛋白质印迹评估破骨细胞分化所必需的NF-κB配体/骨保护素受体激活剂（RANKL/OPG）的比例。体外压缩力上调了hPDLSCs中的RANKL蛋白水平，用GSK219处理可以逆转。相比之下，OPG水平没有显著变化。因此，施加压缩力后，RANKL/OPG比值增加，并且通过与GSK219同时处理部分阻断了这种效应（图5 C）。这些发现证实了hPDLSCs中力诱导的TRPV4可能通过影响RANKL/OPG系统来调节破骨细胞过程。

接下来研究了hPDLSC中TRPV4调节破骨细胞生成的信号通路。ERK蛋白激酶可以通过TRPV4信号激活。此外，ERK还参与了RANKL/OPG的转录调控。因此，假设机械力诱导的hPDLSC中TRPV4的上调可能通过触发ERK信号通路来增加RANKL / OPG比值。为此，在体外施加压缩力之前，用TRPV4的小分子激动剂或拮抗剂对hPDLSC进行预处理。蛋白质印迹结果显示，压缩力导致hPDLSCs中ERK快速磷酸化，TRPV4抑制剂GSK219的额外干预部分减弱了这一磷酸化（图5 D）。此外，在hPDLSC中添加TRPV4激动剂GSK101（10 nmol/L）可增强机械力刺激后ERK磷酸化的诱导（图5 E）。这些结果表明，hPDLSCs中力诱导的TRPV4通过ERK信号通路影响RANKL / OPG系统来调节破骨细胞分化。

图5 TRPV4通过ERK信号通路调节hPDLSCs中力诱导的炎症相关基因表达和核因子-κB配体（RANKL）/骨保护素（OPG）系统的受体激活剂。

图6 PDLSCs中TRPV4在机械应力作用下的激活有助于其生物学性质的变化，并调节牙齿移动过程中的骨重塑。

总之，该研究表明，PDLSCs中TRPV4在机械力下的激活有助于其生物学性质的变化，包括克隆性，增殖，多能分化和免疫调节，并调节牙齿移动过程中的骨重塑（图6）。这些结果表明PDLSCs在机械力诱导的骨重塑中具有关键作用，并表明TRPV4在调节PDLSC功能和介导机械力下骨重塑中的重要性。研究结果还表明，靶向TRPV4可能有益于机械力诱导的骨重塑和牙齿移动。

参考文献：Jin SS, He DQ, Wang Y, Zhang T, Yu HJ, Li ZX, Zhu LS, Zhou YH, Liu Y. Mechanical force modulates periodontal ligament stem cell characteristics during bone remodelling via TRPV4. Cell Prolif. 2020 Oct;53(10):e12912. doi: 10.1111/cpr.12912. Epub 2020 Sep 22. PMID: 32964544; PMCID: PMC7574874.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32964544/

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