循环拉伸应变促进人主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，并通过miRNA-187-3p减少其凋亡

血管平滑肌细胞（VSMCs）的迁移、增殖、凋亡和肥大异常变化是心血管疾病发病机制和病理的共同特征，并伴有细胞表型、形态和结构的变化，进而导致血运重建。因此，对VSMCs表型调控的研究对于阐明心血管疾病的发展和治疗至关重要。

已发现生物力学因素对血运重建的发生和发展有直接和显著的影响。许多研究证实，循环拉伸应变（CTS）可引起血管壁结构的变化，并能调节血管细胞的增殖、凋亡和迁移，从而对细胞外基质的合成、降解和重组产生重要影响。血管中膜的VSMCs在CTS下起着非常重要的作用，可以响应CTS刺激而改变细胞功能。

MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码单链RNA，长约20-24个核苷酸，可参与基因表达的转录后水平调控。越来越多的证据表明，miRNAs在调节VSMC生物行为中起着重要作用。例如，miR-145 被证明是 VSMC 分化和表型转变的主要决定因素，并且在动脉粥样硬化和动脉损伤模型中均下调。以前的研究还表明，CTS通过调节细胞miRNAs的表达参与各种进展过程。例如，CTS 通过miRNA-27a促进骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞样细胞。然而，miRNAs 在CTS调控VSMCs生物学行为中的作用仍有待研究。

在昆明医科大学第一附属医院眼科、血管外科课题组的一项研究中，首次通过SmallRNA-seq阐明了人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）响应CTS下差异表达的miRNAs。此外，选择miR-187-3p进行体外验证对CTS的反应以及对HASMCs表型的影响。研究结果将为CTS 在心血管疾病中的应用提供效应靶点和治疗思路。

实验首先阐明CTS对HASMCs增殖、凋亡和迁移的影响，以1 Hz的频率，10% 和15% 的振幅分别处理HASMCs，持续24 h。MTT结果证实，与NC组相比，5%、10% 和 15% CTS组HASMCs增殖显著增加，HASMCs增殖随CTS振幅的增强而逐渐增加（图1 a）。流式细胞术结果显示，与NC组相比，CTS处理的HASMCs细胞凋亡水平明显降低，HASMCs凋亡随CTS振幅的增强而逐渐降低（图1 b）。Transwell迁移结果表明，与NC组相比，CTS能够增加Transwell下腔室HASMCs的数量（图1 c）。此外，细胞凋亡相关蛋白和迁移相关蛋白的检测结果表明，在CTS处理的HASMCs中，Bax、Caspase 3、MMP2和MMP 9的表达显著增强，Bcl 2的表达显著降低（图1 d-e）。这些结果表明，CTS促进了HASMCs的增殖和迁移，抑制了其凋亡，并且该效应显示了对CTS振幅的依赖性。

图1 CTS对HASMCs生物学行为的影响。

为了探索CTS对HASMCs中miRNA表达谱的影响，实验从CTS处理的HASMCs中提取了mRNA，用于SmallRNA-seq，设定的阈值为 log2FC≥ 1和P < 0.05。与NC组相比，在5%，10% 和15% 的CTS处理的HASMCs中分别有55个（31个上调，24个下调），16个（7个上调，9个下调）和16个（7个上调，9个下调）DE-miRNAs（图2 a-f）。此外，miR-26a-2-3p和miR-187-3p在CTS处理的HASMCs中均显著高表达（图2 g）。研究表明，miR-26a-2-3p和miR-187-3p最有可能是CTS调控 HASMCs 的关键因子，miR-187-3p有531个下游靶点，miR-187-3p有3224个下游靶点，有189 个共同靶点mRNAs（图2 h）。

图2 HASMCs中差异表达的miRNAs对CTS的响应。

为了确定下游靶点的功能和涉及的通路，实验进行了GO和KEGG通路富集分析Metascape。GO富集结果包括了183个生物过程、20个细胞成分和48个分子功能，主要包括“基底外侧质膜”，“内吞循环”，“横纹肌组织发育”，“内吞作用的调节”，“细胞对生长因子刺激的反应”和“蛋白质定位到内体”。KEGG富集显示，189个靶基因富集为总共8个KEGG通路，包括“内吞作用”、“动物细胞自噬信号通路”、“HIF-1信号通路”、“癌症的中枢碳代谢”、“溶酶体”、“丙型肝炎”、“调节干细胞多能性的信号通路”和“小细胞肺癌”。这些结果表明，CTS可以调节细胞增殖，凋亡和迁移。

为了阐明靶基因之间的相互作用，实验利用Metascape进一步构建了189个靶基因的PPI网络，并应用MCODE算法识别PPI网络中的蛋白质紧密连接，以进行聚类构建功能模块（MCODE），其中三个MCODE从PPI网络中鉴定出来。结果表明，MCODE_1 PPI网络蛋白主要富集于网格蛋白有被小窝、运货受体活性和受体介导的内吞作用；MCODE_2 PPI网络蛋白主要富集于调节翻译、DNA修复和细胞酰胺代谢过程调控；MCODE_3 PPI网络蛋白主要富集于肌节、肌原纤维和收缩纤维。

研究人员进一步验证了miR-26a-2-3p和miR-187-3p在CTS调控HASMCs生物学行为中的作用。RT-qPCR结果显示，CTS显著提高了miR-26a-2-3p和miR-187-3p在HASMCs中的表达水平，miR-187-3p的表达水平高于miR-26a-2-3p（图3 a）。因此，选择了miR-187-3p进行后续验证。

应用MiR-187-3p模拟物和miR-187-3p抑制剂调节miR-187-3p的表达水平。结果表明，转染miR-187-3p模拟物后miR-187-3p的表达显著增加（图3 b），并在转染miR-187-3p抑制剂后降低（图3 c）。MTT结果表明，过表达miR-187-3p增强了15% CTS对HASMCs的增殖促进作用，而敲低miR-187-3p产生了相反的效果（图3 d）。流式细胞术结果显示，与15% CTS处理的HASMCs相比，转染miR-3-187p模拟物的HASMC凋亡显著降低，转染miR-3-15p抑制剂的HASMCs细胞凋亡显著增加（图3 e）。Transwell结果显示，miR-187-3p模拟组HASMCs迁移数量显著高于15% 组，而miR-187-3p抑制剂组显著低于15% 组（图3 F）。与15% CTS组相比，过表达miR-187-3p显著下调Bax和Caspase 3 表达，显著上调Bcl2、MMP2和MMP 9表达，而敲低miR-187-3p产生相反的效果（图3 g-h）。这些结果表明，CTS通过上调miR-187-3p的表达来刺激HASMCs的增殖和迁移并抑制其凋亡。

图3 CTS通过miR-187-3p对HASMCs生物行为的影响。

综上所述，该研究阐明了CTS促进HASMCs的增殖和迁移并抑制细胞凋亡，并揭示了HASMCs中通过RNA-seq响应CTS的miRNAs。这表明miR-187-3p可能是CTS导致血运重建的重要靶标。这些结果丰富了生物力学对血运重建的作用机制。但是缺乏体内实验来验证这项研究中的发现，miR-187-3p调控HASMCs表型的分子生物学机制仍有待进一步研究。

参考文献：Yang D, Wei GY, Li M, Peng MS, Sun Y, Zhang YL, Lu C, Qing KX, Cai HB. Cyclic tensile strain facilitates proliferation and migration of human aortic smooth muscle cells and reduces their apoptosis via miRNA-187-3p. Bioengineered. 2021 Dec;12(2):11439-11450. doi: 10.1080/21655979.2021.2009321. PMID: 34895047; PMCID: PMC8810176.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34895047/

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