流体剪切应力通过Piezo1增强T细胞活化

在体内，最佳的T细胞活化既是一个机械过程，也是一个生化过程。Piezo1是一种机械敏感离子通道，响应物理力，例如流体剪切应力（FSS）而开放，并允许钙离子内流。钙内流导致 Piezo1 将物理刺激转化为生化反应，因为钙是参与多种信号通路的第二信使。其中一条通路是T细胞活化，因为钙内流会增加活化T细胞核因子（NFAT）、核因子κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）的活化。然后，这些转录因子诱导细胞因子的产生，这些细胞因子在持续的T细胞活化、分化和细胞毒性中起重要作用。先前的一项研究表明，流体剪切应力（FSS）诱导单个T细胞中的钙内流，这表明通过Piezo1激活的FSS可能具有促炎作用。

在美国范德堡大学生物医学工程系的一项研究中，用FSS处理Jurkat和原代人T细胞，通过以0.5-5.0 dyn/cm2的FSS 梯度处理T细胞来研究生理性FSS的效果。然而，在病理生理学背景下，高血压的血压异常属于血流动力学的改变，与细胞因子水平异常相关，并与多种自身免疫性疾病相关。在高血压患者血管网络的某些区域，血流速度降低，FSS降低。在其他区域，血流速度增加，FSS升高。了解FSS与改变的T细胞活化之间的关系可以为高血压患者自身免疫性疾病的治疗确定新的治疗靶点。这项研究是第一个确定FSS增强T细胞活化的研究，观察结果表明，Piezo1和其他机械敏感离子通道可能是自身免疫性疾病的治疗靶点，或用于改善过继性T细胞免疫疗法。

FSS 增强用 CD3/CD28 抗体处理的 Jurkat 细胞中的 ZAP70 磷酸化

利用永生化Jurkat细胞系，模拟CD3 / CD28抗体联合体外FSS（5.0 dyn/cm2，1h）对T细胞的激活作用（图1 A）。在整个FSS实验中，将剪切应力值保持在静脉和动脉水平，分别为0.5-4.0 dyn/cm2和 4.0-30.0 dyn/cm2。为了确定FSS暴露水平是否对细胞具有细胞毒性，测量了细胞活力。5.0 dyn/cm2 的FSS持续1小时未显著降低细胞活力。

首先用不含抗体的FSS处理Jurkat细胞，以确定单独FSS的激活作用。通过测量zeta链相关蛋白激酶-70（ZAP70）磷酸化来量化，ZAP70 在CD3激活后磷酸化，是T细胞活化的必要步骤。与静态对照相比，单独的FSS仅导致ZAP70磷酸化增加10%（图1 B）。当CD3/CD28抗体与FSS联合时，与仅抗体或未处理的对照相比，ZAP70磷酸化显著增加，约50%（图1 C）。然后用不同幅度的FSS处理Jurkat细胞，以确定T细胞活化对剪切应力的“幅度反应”。实验观察到ZAP70磷酸化的增加与FSS幅度呈正相关（图1 D）。此外，还测量了Jurkat ZAP70磷酸化对FSS-抗体处理时间的依赖性。随着FSS持续时间的增加，ZAP70磷酸化显著增加（图1 E）。

图1 CD3 / CD28抗体和FSS处理对ZAP70的磷酸化作用。

FSS 联合 CD3/CD28 抗体可增加 Jurkat 细胞中晚期 T 细胞活化标志物的表达

为了正常激活T细胞，需要激活转录因子NFAT、NF-κB和AP-1来转录重要的蛋白质和细胞因子，例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-2和干扰素γ（IFN-γ）。实验用FSS联合CD3/ CD28抗体刺激Jurkat细胞1小时后测量每个转录因子的活化。结果观察到，NFAT-核共定位显著增加（图2 A），而且FSS与CD3 / CD28抗体的组合显著增加了NF-κB和AP-1的活化。

FSS处理1小时后测量细胞因子TNF-α，IL-2和IFN-γ的表达，以确定三种转录因子的激活增加是否与维持T细胞功能和激活所需的蛋白质表达增加相关。与对照组相比，当Jurkat细胞用FSS处理1小时时，每种细胞因子的表达均显著增加。FSS处理后24小时后测量了活化标志物CD69和CD25的表达。与对照组相比，FSS-抗体处理组和仅抗体处理组均显示CD69和CD25表达增加。

FSS下CD3 / CD28抗体包被珠增加了Jurkat细胞的活化

实验还用CD3 / CD28抗体包被的磁珠测试了FSS，以确定FSS是否也可以增强使用磁珠激活的Jurkat细胞的活化。用或不用FSS联合抗体包被的磁珠刺激Jurkat细胞1小时。与仅磁珠和未处理的对照相比，FSS处理显著增加了ZAP70的磷酸化。与未处理的对照相比，单独磁珠对照组的ZAP70磷酸化也显著增加，但不如FSS处理组明显（图2 A）。此外，在用磁珠处理1小时后FSS也显著增强了转录因子NF-κB和cFOS的磷酸化。单独磁珠对照组仅显著增加了cFOS的磷酸化，而不是NF-κB（图2 B、C）。当用CD3 / CD28包被珠处理Jurkat细胞时，FSS也显著增加了Jurkat细胞的细胞因子表达。与对照组相比，TNF-α、IL-2和IFN-γ在FSS条件下均大幅上调（图2 D）。

图2 FSS通过CD3 / CD28包被磁珠增加活化。

FSS增强Jurkat细胞中T细胞的活化具有Piezo1 和钙依赖性

为了确定FSS增强的T细胞活化是否通过钙内流起作用，在无钙或含钙的HBSS缓冲液中用抗体加FSS的组合处理Jurkat细胞1小时。用FSS和抗体在含钙缓冲液中处理的Jurkat细胞显示出ZAP70磷酸化显著增加。在无钙缓冲液中用FSS和抗体处理的Jurkat细胞没有显示出ZAP70磷酸化的显著增加（图3 A）。接下来，用或不用钙螯合剂EGTA以2mM的浓度预处理Jurkat细胞30分钟，观察到用EGTA，FSS和抗体处理的Jurkat细胞ZAP70磷酸化显著降低（图3 B）。

为了确定Piezo1是否可能在FSS增强的T细胞活化中发挥作用，实验在FSS和抗体处理前30分钟用10 μM GsMTx-4 处理Jurkat细胞。GsMTx-4是Piezo1的相对特异性抑制剂，但已知也会抑制其他机械敏感通道。GsMTx-4导致用FSS和抗体处理的Jurkat细胞的ZAP70磷酸化显著降低（图3 C）。这表明FSS通过诱导导致钙内流的机械敏感离子通道的激活来增强T细胞活化。为了更具体地量化Piezo1是负责FSS增强Jurkat细胞活化的离子通道的程度，利用CRISPR/Cas9技术敲除Jurkat细胞中Piezo1。在Jurkat Piezo1 敲除细胞中，与未处理或仅抗体处理的细胞相比，FSS处理不会增加ZAP70磷酸化。然而，在Cas9对照Jurkat细胞中，FSS处理显著增加了ZAP70磷酸化。此外，当两者都用FSS处理时，与Jurkat Piezo1 敲除细胞相比，Cas9对照Jurkat细胞中的ZAP70磷酸化显著更高（图3 D）。

实验还研究了钙内流的下游效应，以确定它们是否在FSS存在下增强T细胞活化方面发挥作用。肌动蛋白聚合先前已被确定为有效T细胞活化所必需的，并受钙内流调节。在FSS处理前30分钟用30 μM细胞松弛素D（CCD）预处理Jurkat细胞以抑制肌动蛋白聚合。CCD显著降低了与FSS-抗体处理相关的增加的ZAP70磷酸化，同时在仅抗体条件下没有显著改变Jurkat细胞的活化（图3 E）。

钙调磷酸酶是一种磷酸酶，在钙内流下游被激活，并与NF-κB激活有关。为了确定钙调磷酸酶是否被钙内流激活以增加转录因子活化，通过用5 μM环孢菌素A（CSA）预处理Jurkat细胞30分钟来抑制钙调磷酸酶。CSA处理显著降低了用FSS和抗体处理的Jurkat细胞中的NF-κB磷酸化，表明FSS激活钙调磷酸酶以促进转录因子的激活（图3 F）。

图3 钙内流对于Jurkat细胞中FSS增强T细胞激活至关重要。

FSS增强原代T细胞的活化

为了获得更生理性的T细胞活化模型，并确定FSS处理的活化效果是否与临床中的T细胞疗法相关，实验用抗体和FSS处理原代人T细胞1小时。FSS增强了CD4和CD8-阳性T细胞亚群中ZAP70的磷酸化。这种趋势在NF-κB磷酸化中也很明显，CD4和CD8阳性T细胞的NF-κB磷酸化显着增加。如上所述，细胞因子表达是T细胞活化和功能的另一个重要步骤。因此，FSS处理1小时后，测量两个亚群中原代T细胞的TNF-α，IL-2和IFN-γ的表达。在CD4和CD8阳性T细胞中，与未处理和仅抗体的对照相比，用FSS和CD3 / CD28抗体处理T细胞时，所有三种细胞因子均显著增加。

图4 FSS和CD3 / CD28抗体增强T细胞活化的示意图。

FSS激活Piezo1，使钙流入。钙内流增加ZAP70磷酸化，并激活转录因子NFAT，NF-κB和AP-1。这反过来又导致细胞因子（如IL-2）的表达增加。

总之，该研究表明，5.0 dyn/cm2的生理FSS当受到CD3/CD28抗体刺激时可以增强T细胞的活化。然而，该研究结果也可能与病理生理状态有关，如高血压。实验发现，通过ZAP70磷酸化测量，FSS幅度的增强进一步增加了T细胞活化。高血压与身体某些部位（如左右颈总动脉和冠状动脉）的血流速度增加有关，因此FSS增加。在这些疾病中，已知T细胞都起着重要作用。这项研究的结果以及高血压与自身免疫性疾病之间的相关性表明，抑制T细胞中的Piezo1和其他机械敏感离子通道可能对自身免疫性疾病和细胞因子释放综合征具有治疗潜力。

参考文献：Hope JM, Dombroski JA, Pereles RS, Lopez-Cavestany M, Greenlee JD, Schwager SC, Reinhart-King CA, King MR. Fluid shear stress enhances T cell activation through Piezo1. BMC Biol. 2022 Mar 9;20(1):61. doi: 10.1186/s12915-022-01266-7. PMID: 35260156; PMCID: PMC8904069.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35260156/

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