软骨细胞来源的外泌体促进颞下颌关节骨关节炎的软骨钙化

颞下颌关节（TMJ）是骨关节炎（OA）最常见的部位之一。与其他关节的OA类似，软骨钙化是颞下颌关节OA的变化之一。钙晶体，如碱性磷酸钙（BCP）和焦磷酸钙二水合物（CPPD）晶体，形成钙化结节，进一步刺激软骨炎症和基质降解，加重OA软骨的退化。然而，OA软骨中异常钙化形成的机制仍有待确定。

外泌体是由活细胞分泌的直径为30-100nm的囊泡样小体。研究表明，外泌体可促进动脉粥样硬化和慢性肾脏病等疾病的异常钙化。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，在维持软骨稳态方面至关重要。然而，关于软骨细胞来源的外泌体在OA中的作用的研究很少。此外，颞下颌关节OA期间退变软骨出现明显的异常钙化，软骨细胞周围异常钙化基质中有大量外泌体样双层囊泡结构，提示退变软骨细胞来源的外泌体可能参与颞下颌骨OA软骨异常钙化。

在第四军医大学口腔医学院、郑州大学口腔医学院等研究团队的一项研究中，建立了大鼠单侧前牙反牙合（UAC），从而诱导出TMJ OA的病损，包括软骨厚度减少、基质成分合成减少、基质降解分子表达增加、软骨细胞异常分化等典型OA软骨退变表现；然后采用流体流动剪切应力（FFSS）刺激的颞下颌关节OA大鼠和原代髁突软骨细胞为研究对象，在异常生物力学刺激下，探讨软骨细胞来源的外泌体是否参与OA软骨异常钙化的调控。

TMJ OA大鼠退变软骨存在异常钙化

在UAC刺激大鼠的TMJ髁突软骨出现无细胞区，软骨细胞排列紊乱。同时，软骨基质降解加剧。此外，UAC组髁突软骨钙化层厚度及钙化层占整个软骨厚度的比例均显著高于对照组。随着组织形态学的变化，UAC组大鼠髁突软骨中II型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达显著降低，而软骨细胞去分化标志物基质金属蛋白酶-13、Runt相关转录因子2和骨钙素显著增加。这表明，TMJ OA大鼠退变软骨存在异常钙化

TMJ OA大鼠退变软骨中外泌体增加

IHC染色显示，CD63是外泌体的标志物，主要位于对照组大鼠 TMJ 髁突软骨内的肥大层深层。然而，在UAC组中，在TMJ 髁突软骨的前肥大层中也发现了CD63阳性软骨细胞。在3个时间点上（2、4、8周），UAC组CD63阳性软骨细胞比值均高于对照组，CD63的mRNA表达在UAC 组中也显著高于对照组（图 1 A）。TEM图像显示，与同期对照组相比，在4周和8周时UAC实验组大鼠TMJ髁突软骨肥大层细胞周围基质中存在线性钙化残留痕迹（图1 B）。此外，在软骨细胞和钙化残留痕迹之间，存在大量直径50-100 nm左右类似外泌体的双层膜包裹囊（图1 B）。

MGP是一种钙化抑制分子，而TNAP和NPP1是促进钙化的酶。UAC组大鼠髁突软骨中MGP阳性软骨细胞和Mgp的mRNA表达显著降低。TNAP-阳性和NPP1-阳性软骨细胞的比例以及Tnap和Npp1的mRNA表达在UAC组大鼠髁突软骨中显著增加。

图1 UAC大鼠TMJ OA 软骨中外泌体的形成增加。
（A）UAC大鼠髁突软骨中CD63阳性软骨细胞数量和CD63的mRNA表达增加。（B）TEM观察年龄匹配对照组和UAC组大鼠的髁突软骨。1-6中的白色箭头指出了软骨细胞周围的钙化边缘。1-3显示对照组钙化，4-6显示UAC组钙化，7-9显示钙化基质中外泌体样结构增加。

FFSS促进原代髁突软骨细胞外泌体形成和钙化

为了在体外模拟TMJ OA的异常生物力学环境，用FFSS（4、8和16 dyn/cm2，1小时）刺激大鼠TMJ髁突原代软骨细胞。茜素红染色显示，随着FFSS幅度的升高，髁突原代软骨细胞内钙化结节数量显著增加（图2 A），伴有 CD63 表达的升高（图2 B），提示TMJ髁突软骨细胞在FFSS刺激后分泌外泌体增多。此外，髁突软骨细胞分泌的外泌体MGP随着FFSS值的升高显著降低，而TNAP和NPP1显著增加（图2 C）。

图2 FFSS促进培养的髁突软骨细胞的钙化和外泌体形成，并改变外泌体中的蛋白质水平。
（A）FFSS促进培养的髁突软骨细胞中钙化结节的形成。（B）FFSS促进培养的髁突软骨细胞的外泌体形成。（C） FFSS改变了外泌体中的蛋白质水平，如MGP表达降低以及TNAP和NPP1表达增加。

抑制外泌体形成减轻FFSS诱导的原代软骨细胞钙化

根据以上结果，选择16 dyn/cm2 的FFSS刺激原代髁突软骨细胞。不同浓度的GW4869用于抑制外泌体的形成。茜素红染色显示，GW4869显著且呈剂量依赖性地减少了FFSS刺激后原代髁突软骨细胞中形成的钙化结节的数量（图3 A）。CD63的蛋白质水平也因GW4869而显著降低（图3 B）。然而，分泌的外泌体中MGP，TNAP和NPP1的蛋白质水平不受GW4869的影响（图3 C），表明GW4869对钙化的抑制作用主要是通过抑制外泌体形成而不是通过外泌体内含物的变化来实现的。

为了确定外泌体中的成分是否参与钙化，选择16 dyn/cm2 的FFSS作为刺激条件，分别给予髁突软骨细胞1 μg/ml MGP、10 μM SBI-425（TNAP抑制剂）和10 μM Ennp-1-IN-1（NPP1抑制剂）。茜素红染色显示，加入MGP、SBI-425和Ennp-1-IN-1后，培养的TMJ 软骨细胞中钙化结节的数量显著减少（图3 D），表明对外泌体蛋白质成分的相应作用也可以显著抑制 TMJ 软骨细胞的钙化。

实验还将16 dyn/cm2的FFSS刺激下髁突软骨细胞分泌的外泌体加入到不同浓度的无FFSS刺激培养的髁突软骨细胞培养基中。茜素红染色显示，钙化结节的数量以剂量依赖性方式显著增加（图3 E），表明由FFSS刺激的髁突软骨细胞分泌的外泌体能够促进钙化。

图3 抑制外泌体形成可缓解FFSS诱导的髁突软骨细胞钙化。
（A）用GW4869抑制外泌体形成减少了培养的髁突软骨细胞中FFSS刺激后钙化结节的数量。（B）GW4869减少用FFSS刺激的髁突软骨细胞外泌体形成。（C）抑制外泌体形成不影响FFSS诱导的外泌体中蛋白质水平的变化。（D）补充外源性MGP或抑制TNAP和NPP1可有效减少FFSS刺激的髁突软骨细胞中钙化结节的数量。（E）用FFSS刺激髁突软骨细胞的外泌体促进培养的髁突软骨中钙化结节的形成。

局部注射GW4869可抑制 TMJ OA大鼠软骨的钙化

为了明确抑制外泌体形成对 TMJ OA软骨钙化的治疗效果，实验将外泌体局部注射到UAC大鼠的TMJs 中。与UAC组大鼠相比，注射GW4869的UAC大鼠髁突软骨中的番红O阳性区域显著增加，表明软骨基质中的蛋白聚糖增加。此外，在8周和12周时，GW4869注射组软骨的组织形态分级明显较低（图4 A）。GW4869注射组 TMJ 髁突软骨钙化层厚度及占整个软骨的比例均显著低于UAC注射组（图4 B）。注射GW4869后，Col2a1、聚集蛋白聚糖、Mmp13、Runx2和骨钙素的mRNA表达均下降。

为了验证外泌体在促进体内 TMJ 软骨钙化中的作用，用16 dyn/cm2 的FFSS刺激髁突软骨细胞，收集培养基中的外泌体，然后局部注射到对照大鼠的TMJ中。注射外泌体后，髁突软骨中的番红O阳性区域明显减少，表明软骨基质中的蛋白聚糖减少。此外，在8周和12周时，外泌体注射组软骨的组织形态分级也显著增加（图4 C）。外泌体注射组髁突软骨钙化层厚度及占整个软骨的比例均高于对照组（图4 D）。外泌体注射组中Col2a1、聚集蛋白聚糖的mRNA表达显著降低，而Mmp13，Runx2和骨钙素的mRNA表达增加。

实验还在12周时检测了对照组、外泌体注射组、UAC 组和外泌体抑制剂注射 UAC 组中大鼠 TMJ 髁突软骨中促炎细胞因子（包括 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-18）的表达。结果显示，与对照组相比，外泌体注射组和UAC组促炎细胞因子的mRNA表达显著增加。 同时，与UAC组相比，外泌体抑制剂注射 UAC 组中促炎细胞因子的mRNA表达显著降低。

图4 局部注射GW4869和外泌体对大鼠颞下颌关节软骨退变和髁突软骨钙化的影响。
（A）在注射GW4869的UAC大鼠中，颞下颌关节的软骨退变得到缓解。（B）软骨钙化在注射GW4869的UAC大鼠中得到缓解。（C）在对照大鼠中用外泌体注射诱导TMJ软骨退变。（D）在对照大鼠中用外泌体注射诱导TMJ的软骨钙化。

异常的生物力学负荷会降低颞下颌关节髁突软骨细胞中的钙化抑制剂（如MGP）表达，并增加启动子（如NPP1和TNAP）的表达，从而改变软骨细胞来源的外泌体中相关分子的水平。此外，异常的生物力学负荷促进外泌体的形成和分泌。分泌的外泌体促进软骨基质的钙化。抑制外泌体形成可有效缓解 TMJ OA退变软骨的异常钙化。该研究为外泌体对骨关节炎软骨的影响提供了新的见解，揭示了外泌体不仅在OA过程中诱导炎症变化，还会导致软骨异常钙化，从而使软骨的力学性能变差，进而加剧OA中软骨的破坏。

参考文献：Liu Q, Wang R, Hou S, He F, Ma Y, Ye T, Yu S, Chen H, Wang H, Zhang M. Chondrocyte-derived exosomes promote cartilage calcification in temporomandibular joint osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2022 Feb 14;24(1):44. doi: 10.1186/s13075-022-02738-5. PMID: 35164837; PMCID: PMC8842872.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35164837/

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