PALMD 缺失在瓣膜内皮细胞中激活 NF-κB 信号并加重主动脉瓣膜重塑

2024-03-27Naturethink

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是最常见的瓣膜性心脏病，其特征是进行性重塑，包括瓣膜纤维化和钙化。瓣膜内皮细胞（VECs）在瓣膜发育和稳态中起着关键作用。这些细胞在血液和瓣膜间质细胞（VICs）之间提供保护屏障。在病理环境中，VECs 通过内皮-间充质转化（EndMT）从内皮细胞状态异常转变为间充质样细胞状态。这些过程加速瓣膜重塑并导致狭窄和钙化。

研究表明，CAVD 具有很强的遗传成分。最近的GWAS研究发现了主动脉瓣狭窄的新位点，染色体 1p21 上的 SNP rs7543130和 rs6702619靠近同一基因 palmdelphin （PALMD），与 CAVD 相关，而且rs6702619 位点的 CAVD 风险等位基因与 PALMD 的低表达有关。这些证据都强烈表明 PALMD 表达在 CAVD 风险中具有因果作用。

基于此，首都医科大学附属北京安贞医院杜杰教授团队进行了进一步研究，发现 PALMD 缺失会加重主动脉瓣重塑并损害瓣膜功能。就其机制而言，PALMD 结合 TNIP1 介导TNFAIP3依赖性的去泛素化并抑制 NF-κB 活化，而 PALMD 缺失激活 NF-κB 信号并有助于瓣膜重塑。详细内容发表在 JACC: Basic to Translational Science 期刊题为“Palmdelphin Deficiency Evokes NF-κB Signaling in Valvular Endothelial Cells and Aggravates Aortic Valvular Remodeling”。

首先，为了探索PALMD在主动脉瓣病理生物学中的作用，实验利用Palmd敲除（Palmd−/−）小鼠和Palmd对照小鼠。早期两组小鼠的流出道速度没有差异，然而，在 11 个月和 13 个月时，Palmd+/+−/− 小鼠的主动脉瓣峰值速度增加。鉴于Apoe缺失（Apoe−/−）高龄小鼠容易患上功能性瓣膜性心脏病，因此，实验又生成了 Apoe 和 Palmd 双敲除（DKO）小鼠，发现在 14 个月时，DKO小鼠射血分数降低，瓣膜峰值速度和平均梯度增加。

然后评估了高龄小鼠 CAVD、瓣膜重塑和纤维化的关键特征。DKO小鼠的主动脉瓣叶明显比Apoe−/−小鼠厚（图1 A、B）。Movat染色显示DKO小鼠主动脉瓣叶中有更多的蛋白聚糖（图1 C、D），表明纤维化导致小叶增厚。同样，13 个月大的Palmd−/− 小鼠的蛋白聚糖和胶原沉积增加（图1 E-H）。这些数据表明，PALMD缺失会加剧高龄小鼠的瓣膜细胞外基质（ECM）重塑和瓣膜僵硬，这可能导致主动脉瓣功能下降和CAVD进展。

图1 PALMD缺失导致瓣膜重塑。

接下来，实验通过qRT-PCR评估了不同组织中的 Palmd 的表达，发现PALMD 蛋白在小鼠主动脉瓣的 PECAM1 阳性内皮细胞中高度表达（图2 A）。然后从接受主动脉瓣置换术的患者获得的反流性主动脉瓣中分离出人原发性 VECs 和 VICs。qRT-PCR分析显示，与VICs相比，VECs中的PALMD表达水平明显更高（图2 B）。

然后利用scRNA-seq 数据探讨 PALMD 在 VECs 中的作用，发现了2 个不同的 VEC 簇（VEC-1 和 -2）。有趣的是，PALMD似乎仅限于VEC-1簇（图2 C）。据报道，具有较低 PALMD 表达水平的 VEC-2 簇中的细胞处于从内皮细胞到间质细胞群的过渡状态。因此，实验发现内皮特异性标记基因 PECAM1 和 TIE1 在 VEC-2 簇中的表达显著降低。这些数据表明，PALMD参与内皮细胞特性的维持。

病理性循环应变和剪切应力已被证明会在成熟 VECs 中诱导 EndMT。因此实验继续研究了静态培养或暴露于不同持续时间4.5 dyne/cm2振荡剪切应力（OSS）下EndMT相关基因的表达。与静态培养相比，暴露于OSS的VECs中的间充质基因（ACTA2、SNAIL1、VIM）表达增加，而内皮基因（PECAM1）表达趋于降低。敲低VECs中的PALMD后发现在静态培养（图2 F）和早期暴露的OSS中都会升高VIM的表达。暴露于OSS 24 小时后，VIM、ACTA2 和 SNAIL1 表达均增加（图2 G）。这些数据表明，PALMD 缺失会加速 OSS 诱导的 EndMT，这可能导致 CAVD 加重。

图2 PALMD 影响内皮细胞特性并参与 OSS 诱导的 EndMT。

进一步地，为了研究 PALMD 沉默促进的 EndMT 中涉及的基因表达谱和信号通路，对转染了siCtrl或 siPALMD的 VECs 进行了 RNA-seq。观察结果突出表明，TNF 和 NF-κB 信号通路参与 PALMD 缺失诱导的 VECs 病理。利用LC-MS/MS发现TNFAIP3和IKBKG在NF-κB信号中的相互作用伙伴TNIP1的关联得分最高（图3 B）。免疫沉淀也证实了 TNIP1 和 PALMD 之间的相互作用（图3 C）。

IKBKG泛素化是NF-κB激活的重要步骤。以往研究报告称，TNFAIP3通过去泛素化 IKBKG 作为 NF-κB 的抑制剂发挥作用。TNIP1 将TNFAIP3与 IKBKG 物理连接，并促进 TNFAIP3介导的 IKBKG 去泛素化。因此。实验假设 PALMD 与 TNIP1 相互作用并维持 TNFAIP3介导的 IKBKG 去泛素化和 NF-κB 抑制。结果显示，当与TNFAIP3质粒共转染时，IKBKG泛素化降低，证实了TNFAIP3的去泛素化活性。在PALMD siRNA存在下，与单独使用TNFAIP3相比，IKBKG的泛素化增加（图3 D）。这些数据强调，当PALMD缺失时，TNFAIP3依赖性去泛素化活性降低。进一步的实验表明，PALMD干扰促进了p65磷酸化（图3 E、F）和核易位（图3 G）。

荧光素酶测定显示，PALMD 干扰增加了 NF-κB 转录活性，但是在静息条件下，PALMD过表达对NF-κB转录活性没有影响（图3 H）。PALMD的过表达阻断了PALMD干扰的作用并降低了NF-κB转录活性。这些数据表明，PALMD 缺失会激活 VECs 中的 NF-κB 信号。

图3 PALMD 与 TNIP1 相互作用并调节 NF-κB 诱导的 EndMT。

最后，考虑到PALMD在维持VEC稳态中的保护作用，实验在Apoe−/− 小鼠内皮细胞中过表达Palmd基因。AAV-Palmd组主动脉瓣中的Palmd表达增加（图4 A），峰值速度（图4 B）和平均梯度（图4 C）降低，而两组之间射血分数相等（图4 D）。组织学评估显示，Palmd过表达减少主动脉瓣面积和蛋白聚糖沉积（图4 E-H）。这些数据表明，补充内皮Palmd可以促进主动脉瓣功能并减轻瓣膜纤维化。

图4 PALMD过表达改善了HFD喂养Apoe−/−小鼠主动脉瓣功能下降和瓣膜重塑。

图5 图形概要。

高龄Palmd缺失小鼠表现为主动脉瓣峰值速度增加、主动脉瓣叶增厚和细胞外基质沉积过多，这是钙化性主动脉瓣疾病的关键特征。PALMD主要在主动脉瓣的内皮细胞中表达，PALMD沉默的瓣膜内皮细胞容易发生振荡剪切应力诱导的内皮间充质转化。从机制上讲，PALMD 与 TNFAIP3 相互作用蛋白1 相关，后者是 NF-κB 信号通路中 TNFAIP3 和 IKBKG 的结合蛋白。PALMD 的缺失会损害TNFAIP3依赖性去泛素化活性，并促进 IKBKG 的泛素化和随后的 NF-κB 激活。腺相关病毒介导的 PALMD 过表达可改善钙化性主动脉瓣疾病小鼠的主动脉瓣重塑，表明具有保护作用。

总之，该研究表明，PALMD 通过抑制 NF-κB 诱导在维持瓣膜内皮稳态方面起着至关重要的作用。实验在 Palmd 基因敲除小鼠中发现了主动脉瓣功能下降和瓣膜病理重塑加重，并证明了 TNIP1 是调节 NF-κB 信号通路的 PALMD 相互作用伙伴。这些发现为PALMD对CAVD病理学的参与提供了研究机制基础，并确定了这种常见人类疾病表型的新内皮病因。

参考文献：Han Y, Zhang J, Yang Z, Jian W, Zhu Y, Gao S, Liu Y, Li Y, He S, Zhang C, Li Y, You B, Liu J, Du J. Palmdelphin Deficiency Evokes NF-κB Signaling in Valvular Endothelial Cells and Aggravates Aortic Valvular Remodeling. JACC Basic Transl Sci. 2023 Aug 30;8(11):1457-1472. doi: 10.1016/j.jacbts.2023.06.004. PMID: 38093741; PMCID: PMC10714178.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38093741/

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