肿瘤相关炎性细胞因子增强了骨髓间充质基质细胞对中性粒细胞的保护

间充质基质细胞（MSCs），也称为间充质干细胞，是许多组织中必不可少的细胞成分，有助于组织修复和体内平衡。除了产生成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞外，MSCs 还表现出强大的免疫抑制作用。研究表明，MSCs 可以通过对适应性免疫系统细胞（如 T 细胞和 B 细胞）的免疫抑制作用来促进肿瘤生长和进展。MSCs 迁移到肿瘤部位后，也被证明可以通过募集单核细胞/巨噬细胞来促进肿瘤生长。

中性粒细胞是骨髓中的主要细胞成分，由干细胞增殖和分化为成熟的中性粒细胞。研究表明，中性粒细胞参与肿瘤进展。然而，目前尚不清楚 MSCs 是否以及如何在肿瘤进展过程中影响中性粒细胞。

基于此，温州医科大学大分子药物与规模化制备全国重点实验室及浙江大学医学院附属第二医院妇科研究团队检测了荷瘤小鼠骨髓中的 MSCs 和中性粒细胞，并在体外测试了 MSCs 对中性粒细胞的影响。研究发现 MSCs 保护中性粒细胞免于凋亡，并促进中性粒细胞成熟，可能是通过产生 G-CSF 来实现的，且荷瘤小鼠血清中升高的炎性细胞因子 IFNγ 和 TNFα 可以显著刺激 MSCs 产生更多的 G-CSF。这些发现表明，MSCs 可以影响中性粒细胞，并可能为肿瘤免疫治疗提供潜在的治疗靶点。研究成果发表在 Frontiers in Immunology 期刊题为“Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines”。

首先，为了确定骨髓中的 MSCs 是否可能影响中性粒细胞，评估了野生型（WT）和荷瘤小鼠（10 周龄 MMTV-pyMT）中的 MSCs 和中性粒细胞。与对照组相比，荷瘤小鼠中 MSCs 的百分比和绝对数量增加，表明骨髓中的 MSCs 对肿瘤进展有反应。来自骨髓的 MSCs 进一步表征为 CD73- CD45- CD11b- Sca1+ CD44+ CD29+。有趣的是，与对照组相比，荷瘤小鼠的中性粒细胞也相应地富集。这些数据表明，MSCs 和中性粒细胞在荷瘤小鼠的骨髓中均升高。

值得注意的是，与野生型小鼠相比，荷瘤小鼠的中性粒细胞核分叶（nuclear segmentation）显著增加（图1 A），表明 WT 和 PyMT 小鼠之间中性粒细胞特征存在潜在差异。为了说明 PyMT 和 WT 小鼠乳腺中中性粒细胞之间的差异，进一步分析了 GSE164766 的 RNA-seq 基因表达，结果显示，2877 个基因（832 个显著下调和 2045 个显著上调）在两组之间差异表达（图1 B）。KEGG 分析显示，基因集的变化与 MAPK 信号通路、NF-kappa B 信号通路和 PI3K-Akt 信号通路密切相关（图 1 C）。然后，对 2877 个 DEGs 进行了 GSEA 分析，显示上述三种通路的基因特征在 PyMT 组中显著富集（图1 D、E）。通路图显示，与细胞周期、存活和炎症相关的基因调控因子上调，提示荷瘤小鼠来源的中性粒细胞可能具有更强的增殖、抗凋亡和促瘤能力。

图1 鉴定源自 WT 和 PyMT 小鼠的中性粒细胞之间的 DEG。

接下来，为了探讨 MSCs 对中性粒细胞的可能影响，分别从骨髓中分离出中性粒细胞和 MSCs，共培养 24 小时。有趣的是，当与 MSCs 共培养时，反映细胞凋亡的 Annexin V+ 中性粒细胞显著减少（图2 A）。一致地，共培养物中剩余的中性粒细胞更多（图2 B）。此外，在共培养中，中性粒细胞更成熟，反映在细胞核分叶的增加（图2 C）。这些数据表明，MSCs 可能充当骨髓中中性粒细胞的保护者，使其免于凋亡并促进成熟。

图2 MSCs 减少中性粒细胞凋亡并促进中性粒细胞成熟。

进一步地，实验确定了 MSCs 对中性粒细胞的保护作用是否是由 MSCs 产生的可溶性因子介导的。为此，在有或没有 MSC培养基（MSC-CM）的情况下培养中性粒细胞。与对照组相比，MSC-CM 减少了中性粒细胞凋亡并防止了中性粒细胞的丢失（图3 A、B），表明来源于 MSCs 的某些细胞因子可能介导了保护作用。

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）均能促进中性粒细胞的产生，直接对中性粒细胞起作用而增强该细胞的功能。因此，检测了 MSCs 条件培养基中 G-CSF 和 GM-CSF 的水平，发现与检测不到两者水平的对照组相比，MSCs 上清液中只有 G-CSF 升高（图3 C）。此外，荷瘤小鼠血清中的 G-CSF 水平较高，但在 WT 组中检测不到（图3 D）。有趣的是，作为关键炎性细胞因子的 IFNγ 和 TNFα 水平在荷瘤小鼠中也显著增加（图3 D）。

为了测试肿瘤相关的 IFNγ 和 TNFα 是否可以刺激 G-CSF 的产生，使用这两种细胞因子处理 MSCs，发现用 IFNγ 和 TNFα 联合处理的 MSCs 在 mRNA 水平和蛋白质水平上比未处理或用单一细胞因子处理的 MSCs 产生更多的 G-CSF（图3 E），表明 MSCs 可能通过产生 G-CSF 对中性粒细胞发挥保护作用，并且 MSCs 中的 G-CSF 表达在肿瘤微环境特征的炎症条件下进一步上调。这些数据表明，G-CSF 在 MSCs-中性粒细胞轴中起关键作用。

图3 TNFα 和 IFNγ 诱导 MSCs 产生更多的 G-CSF。

研究验证了 IFNγ 和 TNFα 处理的 MSCs 是否可以更有效地保护中性粒细胞，发现用 IFNγ 和 TNFα 处理的 MSCs 确实显示出减少的中性粒细胞凋亡，且维持中性粒细胞数量的能力增强（图4 A、B）。利用抗体阻断 G-CSF 可以减弱对中性粒细胞的保护作用（图4 C）。此外，在暴露于 IFNγ 和 TNFα 处理的 MSCs 的中性粒细胞中观察到更多的分叶过多的细胞核，但当使用抗体消除 G-CSF 信号时，则没有这种影响（图4 D）。这些数据表明，IFNγ 和 TNFα 诱导的 MSCs 可以通过 G-CSF 信号进一步保护中性粒细胞并促进其成熟。

图4 IFNγ 和 TNFα 处理的 MSCs 显示出更强的减少中性粒细胞凋亡和促进中性粒细胞成熟的能力。

总之，该研究结果表明，骨髓 MSCs 可以在体外保护中性粒细胞免于凋亡，并促进其分化为多分叶中性粒细胞，在炎症条件下，MSCs 可以产生更多的 G-CSF 来富集中性粒细胞，发挥越来越强的保护作用，表明 MSCs 可能在骨髓中性粒细胞的形成中发挥关键作用。总之，这些结果为骨髓中 MSCs 在炎症和肿瘤发生过程中的潜在功能提供了见解。

参考文献：Liang Y, Lou X, Xu Y, Zheng Z. Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines. Front Immunol. 2024 Apr 16;15:1361596. doi: 10.3389/fimmu.2024.1361596. PMID: 38690266; PMCID: PMC11058655.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38690266/

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