JAG1-NOTCH4 机械感应驱动动脉粥样硬化

血流产生机械剪切应力，通过改变血管内皮细胞（ECs）的生理机能，对血管功能产生深远影响。具有均匀几何形状的动脉树区域受到单向的高生理剪切应力，发挥 EC 保护作用并防止动脉粥样硬化的发生。然而，动脉的分支和弯曲部分暴露于复杂的血流模式中，产生方向变化的低平均剪切应力（如双向振荡和涡流），这些紊乱的血流条件会促进 EC 功能障碍和动脉粥样硬化的发生。

Notch 信号通路在调控细胞进程、调节细胞命运方面起至关重要的作用。哺乳动物中有四个受体（Notch1-4）和五个配体（Delta-like（DLL）1，3，4 和 Jagged（Jag）1-2）。经典研究表明，相邻 EC 上 NOTCH1 及其配体 DLL4 之间的相互作用在血管生成过程中建立了“尖端”与“柄”细胞身份，并且 NOTCH1 和 DLL4 通过抑制缺血组织中的 EC 增殖和新生血管形成对动脉功能至关重要。Notch 的激活需要配体内吞作用诱导的机械力，而 NOTCH1 对剪切应力的感应在动脉分化和血管稳态保护中起重要作用。然而，Notch 系统在致动脉粥样硬化扰动流的 EC 传感中的潜在作用尚未得到研究。

基于此，英国谢菲尔德大学感染、免疫和心脑血管疾病系、中国西南医科大学药学院及美国芝加哥大学生物医学科学系等研究团队曾利用几种互补的实验方法（猪动脉实验血流修饰的小鼠动脉和培养的人EC）表明了扰动流主要激活 JAG1-NOTCH4 通路。其条件性基因缺失表明，Jag1 特别是在易患病的血流紊乱区域增强动脉粥样硬化；单细胞 RNA 测序和其他机制方法表明，JAG1-NOTCH4 信号通过抑制对增殖至关重要的 EC 亚群来促进动脉粥样硬化。这些数据从根本上推进了我们对 Notch 信号在解释剪切应力信号控制 EC 功能中的作用的认识，并对动脉粥样硬化中 Notch 通路的治疗靶向具有重要意义。研究成果发表在 Science Advances 期刊题为“JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis”。

实验假设 Notch 受体和配体在暴露于不同流动条件的动脉位置可能具有不同的空间表达模式，通过 qRT-PCR 分析对从暴露于受干扰的低振荡剪切应力（LOSS）或高剪切应力（HSS）的区域分离的猪主动脉 EC 中 Notch 受体及其配体的转录物表达水平，发现与 HSS 相比，JAG1 和 NOTCH4 mRNA 在 LOSS 位点的表达显著增强，而 JAG2、DLL1、DLL3、DLL4、NOTCH1、NOTCH2 和 NOTCH3 的表达在这些位点之间相似（图1 A）。

然后，量化小鼠主动脉弓中 JAG1 和 NOTCH4 蛋白的表达。表面染色显示，与小鼠主动脉弓中的 HSS 区域相比，JAG1 和 NOTCH4 蛋白在 LOSS 区域的表达水平更高（图1 B、C）。利用免疫荧光光片成像技术对高胆固醇血症载脂蛋白E（ApoE）-/- 小鼠的病变动脉区域进行分析发现，与相邻的非斑块区域相比，JAG1 和 NOTCH4 在动脉粥样硬化斑块区域富集，表明其在动脉粥样硬化中具有潜在作用（图1 D）。这些数据表明，JAG1 和 NOTCH4 在动脉粥样硬化易感部位的内皮细胞和动脉粥样硬化斑块中富集。

使用收缩袖带改变小鼠颈动脉的血流在下游产生振荡剪切应力，评估 JAG1 和 NOTCH4 是否直接对剪切应力敏感，结果显示，14 天后下游区域的 JAG1 和 NOTCH4 显著增强（图1 E、F）。相比之下，JAG1 和 NOTCH4 的表达在具有生理血流的对侧动脉中几乎检测不到。因此，JAG1 和 NOTCH4 在袖带内曲率和下游区域的富集可能是对 LOSS 的反应。

图1 JAG1和NOTCH4在动脉粥样硬化倾向位点富集。

进一步地，分析人冠状动脉 EC（HCAEC）对血流（LOSS：±4 dyne/cm2，0.5 Hz；HSS，13 dyne/cm2）的反应。Notch 配体 JAG1、JAG2、DLL3 和 DLL4 的 mRNA 水平因 HCAEC 中的剪切应力而显著改变，其中 JAG1 在 LOSS 下表达最高（图2 A）。此外，JAG1 是在蛋白质水平上持续被 LOSS 增强的 Notch 配体（图2 B），但 DLL4 蛋白未受流动影响（图2 B）。在 Notch 受体中，NOTCH4 在 mRNA（图2 A）和蛋白质（图2 C）水平上都因 LOSS 而增强，这与信号转导增加有关，NOTCH4 活性和裂解的胞内结构域（N4ICD）增加证明了这一点（图2 C、D）。暴露于静态条件下的 HCAEC 中的 JAG1 和 NOTCH4 mRNA 水平较低，证实它们具有流动响应性。这些数据表明，JAG1 和 NOTCH4 是暴露于 LOSS 的人 EC 中的主要 Notch 成分，这与体内研究一致。

此外，使用 JAG1 的活性阻断抗体和 DLL4 阻断抗体作为对照进行比较，研究了 JAG1 是否在 LOSS 下作用于 NOTCH4 的上游。在暴露于 LOSS 的 HCAEC 中，阻断 JAG1 显著降低了 N4ICD 激活，而阻断 DLL4 活性没有显著影响（图2 E）。anti-JAG1 或 anti-DLL4 阻断抗体未改变 NOTCH4 mRNA 的总水平。这些数据表明，JAG1 激活NOTCH4 是 LOSS 条件下的关键通路。

图2 JAG1-NOTCH4通路是由LOSS体外诱导的。

接下来，为了描述内皮 Jag1 在动脉粥样硬化中的作用，生成 EC 特异性 Jag1 敲除小鼠，并暴露于高脂饮食产生高胆固醇血症和动脉粥样硬化病变（图3 A、B）。在高胆固醇血症小鼠中，与对照组相比，Jag1ECKO 小鼠整个主动脉的病变面积显著减少（图3 C、D）。进一步分析显示，Jag1ECKO 导致主动脉弓病变面积减少，但降主动脉（图3 D）病变面积未减少，主动脉根部的病变区域也没有改变（图3 E、F）。因此，Jag1 在具有特定流动条件的解剖学不同部位上促进动脉粥样硬化，尤其是在血流紊乱部位。

图3 内皮细胞Jag1的缺失减少了主动脉弓斑块的形成。

为了阐明 JAG1 依赖性动脉粥样硬化的潜在机制，对对照和 Jag1ECKO 主动脉进行 scRNA-seq。SORT-seq 分析确定了 14 个不同的集群。其中，簇 0-11 一致表达多种 EC 标志物，与以前发表的小鼠主动脉的 EC 簇非常相似。这些观察结果证实了正常小鼠主动脉中存在异质性。簇 4-6 中的大多数细胞来自 Jag1ECKO 小鼠，而簇 2 和 7-11 的细胞主要来自对照小鼠，表明 Jag1 对 EC 异质性有深远的影响。特别是，与细胞增殖和迁移相关的多个 GO terms 在 Jag1ECKO 小鼠富集，表明 Jag1 抑制参与增殖和迁移的 EC 亚型。

然后，分析了体外暴露于 LOSS 的 HCAEC 中的 JAG1 功能。RNA-seq 显示 859 个基因因抑制 JAG1 而显著改变，DAVID 功能注释发现，最高度富集的 GO terms 集中在细胞分裂过程和细胞分裂/迁移（图4 A-C）。因此，确定 JAG1 是 EC 增殖的调节因子。通过使用基因沉默或活性阻断抗体抑制 JAG1-NOTCH4 通路可显著增强 LOSS 下的 HCAEC 增殖和迁移，证实了这一联系（图4 D、E）。此外，pan-Notch 抑制剂 DAPT 增强了暴露于 LOSS 的 HCAEC 的增殖，这与 JAG1 水平降低相关，而 DLL4 没有改变，从而进一步证实了扰动流下 JAG1、Notch 与增殖之间的联系。同样，Jag1 的缺失导致暴露于 LOSS 的小鼠主动脉区域的 EC 增殖增加（图4 F），但不影响暴露于 HSS 的区域的 EC 增殖。因此，JAG1-NOTCH4 通路在扰动流下抑制了增殖和迁移。

为了研究 JAG1 的作用是否具有细胞自主性，分析了 JAG1 沉默细胞是否可以影响共培养细胞的增殖，结果发现，共培养细胞的增殖均显著增强，表明 JAG1 通过非细胞自主机制驱动增殖，其机制可能涉及细胞间接触。这些数据表明，JAG1-NOTCH4 的LOSS 感应通过改变 EC 异质性以抑制控制增殖和迁移的 EC 亚群来增强疾病易感性。

图4 LOSS激活JAG1导致内皮修复受到抑制。

图5 动脉粥样硬化中JAG1-NOTCH4 控制修复性内皮亚群的假设。实验假设 LOSS 激活 JAG1-NOTCH4 信号，通过改变修复性和致病性 EC 亚群的平衡来促进动脉粥样硬化。

总之，JAG1-NOTCH4 对 LOSS 的感应通过改变 EC 异质性促进动脉粥样硬化，实验假设该通路抑制了负责血管修复的亚群。这些数据表明，JAG1-NOTCH4 在感知疾病引发的 LOSS 中具有重要作用，并表明 JAG1-NOTCH4 的治疗靶向可能是一种新的治疗策略，可增强修复性 EC 亚群以预防或治疗动脉粥样硬化。

参考文献：Souilhol C, Tardajos Ayllon B, Li X, Diagbouga MR, Zhou Z, Canham L, Roddie H, Pirri D, Chambers EV, Dunning MJ, Ariaans M, Li J, Fang Y, Jørgensen HF, Simons M, Krams R, Waltenberger J, Fragiadaki M, Ridger V, De Val S, Francis SE, Chico TJ, Serbanovic-Canic J, Evans PC. JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis. Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7958. doi: 10.1126/sciadv.abo7958. Epub 2022 Aug 31. PMID: 36044575; PMCID: PMC9432841.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36044575/

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