流动依赖性剪切应力影响从人牙髓中分离的周细胞样细胞的生物学特性

流动依赖性剪切应力影响从人牙髓中分离的周细胞样细胞的生物学特性

周细胞是类似于血管平滑肌细胞的一类细胞,因定位于毛细血管及微血管基膜周围而得名。值得注意的是,周细胞的生物学行为依赖于内皮细胞(ECs)通过激活多种通路和释放促血管生成因子(如PDGF-B、Ang-1/Ang-2/Tie2)施加的控制,这些因子在胚胎或病理血管生成中至关重要。此外,ECs和周细胞之间的相互作用不仅受到生化刺激的影响,还受到机械/物理因素的影响,包括血压和流动依赖的剪切应力,这些因素也可能影响它们的串扰和细胞功能。事实上,流动依赖性剪切应力(FSS)在不同的病理状况中起着关键作用,包括慢性肝病。FSS改变可能会影响间质微环境和归巢细胞的生物学行为,导致炎症过程和促纤维化转变。这些变化可能相互支持。

人牙髓分离的周细胞样细胞(hDPSCs)具有独特的干细胞特性,赋予它们高增殖率、免疫调节特性和低免疫原性。研究证明,与预先激活的外周血单个核细胞(PBMCs)共培养的hDPSCs通过激活免疫检查点(包括PD1 / PD-L1和Fas / FasL通路)以及调节主要参与炎症反应的细胞因子的表达来发挥免疫调节/抗炎特性。

了解炎症和干细胞之间的串扰引起了科学界的巨大兴趣,因为它可能阐明干细胞响应组织损伤的激活机制以及如何塑造它们以保持组织稳态。基于这些前提,意大利摩德纳雷焦艾米利亚大学医学、牙科和形态学科学系的研究团队为了更好地阐明周细胞在FSS诱导的病理状况中的作用,使用了从人牙髓中分离的周细胞样细胞群,评估了流动依赖性剪切应力如何影响 hDPSCs 的生物学特性,以预测它们在生理和病理生理条件下的潜在作用。

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周细胞样细胞的血管生成潜力

周细胞与血管生成密切相关,并参与血流动力学过程。此外,血管周围的细胞表达PDGFR-β,这是一种典型的周细胞标志物。该研究的第一个目的是确认hDPSCs的血管生成能力。总体而言,在诱导内皮细胞分化期间,hDPSCs失去了其典型的成纤维细胞样形态。在定型3天和5天后,细长的内皮细胞形态发生了明显的变化。诱导7天后,细胞组装成线状血管(图1 A)。鬼笔环肽染色进一步支持这些数据(图1 B)。同时,对分化的hDPSCs的WB分析显示,与未分化的hDPSCs相比,PDGFR-β表达在统计学上显著降低。HUVEC细胞不表达PDGFR-β,证实其内皮表型(图1 C)。免疫荧光图像证实这一结果(图1 D)。

Cleaved Caspase-3的蛋白质印迹分析显示,内皮诱导不影响hDPSCs的细胞活力(图1 E)。此外还研究了典型内皮标志物ANGPT1,Tie2,eNOS和VEGF的表达。WB分析显示,eNOS和VEGF在内皮细胞分化过程中有统计学意义的上调,在作为阳性对照的HUVEC中达到相似的表达。关于Tie2受体的表达,仅在诱导7天时观察到统计学上的显著升高,而在其配体ANGPT1中没有观察到统计学上的显著差异。值得注意的是,所有这些内皮标志物的基础水平在未分化的hDPSCs中表达,表明它们具有血管生成潜力。为了评估hDPSCs形成管状结构的能力,进行了功能测定。结果表明,在未分化的hDPSCs中也观察到管状血管网络的形成。在诱导内皮分化后,hDPSCs的这种能力显著增强。

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图1 hDPSCs的内皮分化。


流动剪切应力介导的效应分析

剪切应力作用于内皮细胞和/或周细胞,可在血管稳态和重塑以及病理生理学过程中起关键作用。许多细胞结构,包括代表暴露于外部刺激的第一层的细胞膜,通过调整其形状来响应剪切应力。基于这一考虑,实验接下来分析了流动剪切应力介导的效应。暴露于FSS(1.5 dyn/cm2)的hDPSCs重新排列了它们的形态(图2 A)。因此,细胞显得更加细长,失去了其典型的成纤维细胞样形态(图2 A,黑色箭头)。为了排除FSS诱导干性表型改变的可能性,对在标准静态条件下培养的hDPSCs和暴露于FSS(即动态条件)的hDPSCs进行了FACS分析。结果表明,FSS没有改变两个实验组hDPSCs上典型MSCs标志物的表达。事实上,几乎所有的hDPSCs对CD73、CD90和CD105呈阳性,而对CD34、CD45和HLA-DR呈阴性(图2 B)。

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图2 单向脉动流动剪切应力对hDPSCs的影响。


在hDPSCs膜修饰反应的初始机械感应之后,可能发生了局部生化反应和下游细胞内信号通路的激活。因此,实验评估了暴露于FSS的hDPSCs的不同激活通路。如图3 A,热图和直方图揭示了不同信号机制的激活情况。首先,FSS没有诱导hDPSCs中的促凋亡信号通路。通过分析,发现是Akt/mTOR通路响应于脉动单向流动依赖性剪切应力而被激活。与静态条件下的hDPSCs相比,动态条件下hDPSCs中Akt pS473的上调与mTOR pS2481显著增加相关。同时,Akt pT308的磷酸化在两个实验条件下都没有变化,PDK1 s241的磷酸化在暴露于FSS的hDPSCs中显著降低。这些数据表明,Akt/mTOR通路的激活是由于hDPSCs膜变形和机械传感激活的。此外,值得注意的是,FSS诱导PD-L1免疫调节标志物的显著降低。同时,在动态条件下维持的hDPSCs显示出NFkB pS536的强烈上调,同时IKBα pS32 36的显著降低,据报道其磷酸化与NFkB失活有关。这些数据可能表明,脉动血流剪切应力调节hDPSCs的促炎命运。

有趣的是,FSS诱导eNOS pS117显著下调,同时诱导eNOS pS113显著上调。这些数据表明,在eNOS活性受到抑制同时,FSS也影响hDPSCs血管生成的潜在倾向。通过典型血管生成标志物(VEGF、ANGPT1 和 eNOS)的免疫荧光染色和管形成测定证实了这一数据。特别是假色分析显示,暴露于动态培养条件的hDPSCs中VEGF,ANGPT1和eNOS的表达降低(图3 B)。同时,与静态培养条件下的hDPSCs相比,在动态条件下hDPSCs中管状结构的数量在统计学上显著减少(图3 C),从而证实FSS也影响了hDPSCs形成管状血管网络的能力及其随后的血管生成潜力。

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图3 FSS在hDPSCs中诱导的机械转导。


hDPSCs对流动依赖性剪切应力下的免疫调节和炎症反应

最后,实验研究了动态流动条件对hDPSCs与预激活的CD3/CD28 hPBMCs之间共培养模拟的炎症微环境的影响(图4 A)。在与有或没有FSS的PBMCs共培养后,由RPPA对hDPSCs进行生物学分析。之前已经确认了机械传感转导激活了Akt/mTOR通路。特别是,如图4 A,直方图显示,与静态条件下的hDPSCs相比,动态条件下hDPSCs中 Akt pS473的显著增加与mTOR pS2481增加相关。此外,在两种实验条件下,Akt pT308的磷酸化均未检测到统计学上的显著差异,而在与暴露于FSS的PBMCs共培养后,PDK1 S241的磷酸化在hDPSCs中显著降低。在该共培养系统中,暴露于FSS的hDPSCs的eNOS活性受到抑制,如eNOS pS117的显著下调以及eNOS pS113的显著上调(图4 A)。随后,还研究了与PBMCs共培养后暴露或不暴露于FSS的hDPSCs的免疫调节特性。与静态条件下的hDPSCs相比,FSS的应用在动态条件下大大降低了hDPSCs中PD-L1的表达(图4 A)。同时,在与PBMCs共培养后,动态条件下hDPSCs的NFkB pS536明显增加,IKBα pS32 36显著降低(图4 A),表明促炎命运是由FSS驱动的。

为了确认hDPSCs在免疫调节中的可塑性,实验评估了在静态和动态条件下预激活的PBMCs与hDPSCs共培养后的细胞内炎性细胞因子。FACS分析表明,在静态或动态共培养后,PBMCs中hDPSCs的污染最小且相当(图4 B)。具体而言,与静态条件下相比,FSS能够诱导动态条件下单独预激活的PBMCs中所有细胞因子的mRNA表达水平的上调。此外,在动态条件下进行hDPSCs共培养后,PBMCs中IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的mRNA表达水平显著增加(图4 C)。相反,与在静态条件下单独培养的PBMCs相比,在静态条件下与hDPSCs共培养后,PBMCs中检测到细胞因子水平(IFNγ,TNFα,IL-2,IL-10)的下调(图4 C),除了IL-6在hDPSCs静态条件共培养后上调(图4 C)。这些数据表明,FSS对hDPSCs的促炎行为产生了强烈的影响。

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图4 炎症微环境对暴露于FSS的hDPSCs的影响。


综上所述,可以说机械力可能决定hDPSCs的生物学命运,hDPSCs可能在由炎症微环境建立驱动的疾病发展过程中被激活,例如自身免疫性疾病和癌前病变。在这方面,已知间充质干细胞与免疫细胞具有活跃的相互作用,因此可能通过充当炎症的传感器和切换器来显示抗炎和促炎作用。此外,该研究的数据为理解周细胞样细胞和机械力在炎症依赖性疾病的触发和发展中的潜在作用提供了引导。


参考文献:Bertani G, Di Tinco R, Bertoni L, Orlandi G, Pisciotta A, Rosa R, Rigamonti L, Signore M, Bertacchini J, Sena P, De Biasi S, Villa E, Carnevale G. Flow-dependent shear stress affects the biological properties of pericyte-like cells isolated from human dental pulp. Stem Cell Res Ther. 2023 Feb 18;14(1):31. doi: 10.1186/s13287-023-03254-2. PMID: 36805780; PMCID: PMC9938980.
原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36805780/


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