剪切应力调控Glypican-4在内皮功能障碍中的表达及其在动脉粥样硬化中的临床意义

动脉粥样硬化的特征主要表现为血管内层（内膜）出现脂质沉积、炎症反应、细胞增生等改变，形成斑块。通过与细胞外基质分子（尤其是蛋白聚糖）相互作用，致动脉粥样硬化脂蛋白在内皮下基质中的沉积被认为是关键的潜在机制。在病理条件下，脂蛋白会发生氧化、糖化、水解和硫酸化等改变，从而促进炎症并增强动脉粥样硬化生成过程。

动脉粥样硬化斑块的形成常发生在动脉分叉处，此时血流模式为湍流，产生不均匀的剪切应力。粥样斑块的区域的湍流模式会引起炎症反应增加，这反过来似乎增加了斑块破裂的可能性。因此，动脉粥样硬化易发区域的内皮细胞（ECs）表达更高水平的炎症触发因子，从而使斑块的不稳定性增加，导致斑块破裂或斑块侵蚀。

血管ECs的管腔表面被糖萼覆盖，糖萼是1-5μm厚的细胞外层，由糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白组成。完整的糖萼被认为具有动脉粥样硬化保护作用。硫酸乙酰肝素（HS）是表面糖萼层的糖胺聚糖成分，具有许多可能影响动脉粥样硬化生成的功能。在心血管ECs的糖萼中发现的主要硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）主要包括位于细胞膜表面的磷脂酰肌醇蛋白多糖家族（glypicans，GPCs）和多配体蛋白多糖家族（syndecans，SDCs）以及位于细胞外基质中的基膜蛋白多糖（perlecan/HSPG2）。其中，SDC1或SDC4缺失可促进动脉粥样硬化斑块的形成，即使在通常受层流保护的区域也是如此。然而，迄今为止只研究了有限数量的蛋白聚糖。特别是，glypican-4（GPC4）的作用尚不清楚。GPC4作为一种脂肪因子调节胰岛素受体信号传导，因此可能与肥胖和心血管疾病相关，但尚不清楚内皮细胞GPC4的表达是否在动脉粥样硬化形成中起作用。

最近，德国埃尔朗根-纽伦堡大学医学院心脏病学和心血管学系、纽伦堡总医院血管及腔内血管外科及加拿大阿尔伯塔大学公共卫生学院的一项联合研究假设内皮细胞GPC4的表达通过调节内皮活化和免疫细胞粘附在动脉粥样硬化发生中发挥作用。相关内容发表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊题为“The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis”。

首先，实验使用流式细胞术确认了GPC4在人脐动脉内皮细胞（HUAECs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中表达，而且无论孵育时间或样本性别如何，HUVECs中的GPC4表达均高于HUAECs。然后在有或没有肿瘤坏死因子（TNF）-α刺激的HUVECs和HUVECs中，分别观察第0天和第7天mRNA的表达水平。大多数分析的基因（总共26个基因）对TNF-α刺激没有反应，GPC4 表达不受TNF-α刺激的影响，尤其是在HUVECs 中。分析表明，GPC4表达可能与胆固醇转运相关基因的差异表达相关，无论是在第7天还是在第0天以及有与没有TNF-α刺激的条件下。

接下来，将 HUVECs 暴露于流动刺激中 1 天或 10 天（10.2-10.8 dyne/cm²，即高剪切应力、层流模式；2.5-3.5 dyne/cm²，即低剪切应力、不均匀的流动模式），并使用免疫细胞化学染色观察 GPC4 和 HS（图1 A）。在初步实验中，HUAECs和HUVECs之间GPC4和HS的表达没有差异，因此，仅使用HUVECs进行动态流动实验。结果观察到免疫标记的GPC4和HS在层流区和湍流区在1天后的荧光强度呈正相关，在10天后减弱。

在1天和10天的流动刺激后，GPC4在非均匀流区的表达较层流区显著降低（图1 B，左）。GPC4的表达随流动时间的延长总体呈下降趋势。在层流和非均匀剪切应力区域，1天后HS的校正细胞总荧光有显著差异，但在10天后无差异（图1 B，右）。此外，观察到HS表达模式的流动依赖性差异，在1天的流动之后，层流区域观察到网状模式，在非均匀剪切应力区域存在连续中断，而10天后，两个区域的模式都被破坏（图1 C）。这说明GPC4的表达受剪切应力的调控。

图1 流动条件下HUVECs中GPC4的表达。

在1天或10天的流动暴露后，用TNF-α刺激HUVECs，并量化THP-1细胞的粘附。在两个暴露期，与非均匀剪切应力区相比，层流区域的THP-1粘附细胞数量显著降低。非均匀区THP-1细胞粘附数量在10天后比1天后有增加的趋势。

为了研究内皮GPC4是否在THP-1细胞粘附中起作用，通过siRNA转染在HUVECs中敲低GPC4，并进行粘附测定。转染GPC4 siRNA的HUVECs在层流和非均匀剪切应力区THP-1细胞粘附显著高于转染对照 siRNA的HUVECs，而VCAM-1和E-selectin的表达无显著差异。用HS降解酶肝素酶III处理可降低HUVECs中的HS，但对THP-1单核细胞粘附无影响。此外，肝素酶III处理对GPC4 siRNA转染的ECs对THP-1细胞粘附没有额外的影响。

进一步地，实验还分析了GPC4在体外表达中的可能的性别差异。虽然在静态条件下培养的ECs的FACS分析中未观察到性别差异，但发现，在层流和非均匀剪切应力区域的流动条件下，与男性样本相比，女性的GPC4蛋白表达往往更高。此外，层流和非均匀剪切应力区域之间的差异在女性中比在男性中更明显。然而，在HS的表达或THP-1细胞的粘附方面，男性和女性之间没有发现显著差异。

此外，还分析了糖萼成分在人类动脉粥样硬化病变中的分布。GPC4、HS和 SDC4 的表达百分比在炎症较重的PS中低于炎症较轻的PS（图2）。相关性分析表明，SDC4与HS的表达在重度和轻度炎症的PS中均呈正相关，GPC4和HS之间以及GPC4和SDC4在炎症较轻的PS中也观察到这些正相关的趋势。此外，HS与GPC4、HS与SDC4的表达也呈显著正相关。

图2 GPC4、HS和SDC4在所有斑块切片（plaque sections，PS）中的表达。

最后，实验将所有斑块切片分为脆弱、稳定或初始斑块部分。初始斑块切片显示糖萼分子都没有显著差异。在稳定斑块切片中，SDC4和HS在炎症程度较高和较低的PS区域的表达差异有统计学意义，而在GPC4中未达到统计学意义。在脆弱的斑块切片中，与炎症较轻的PS相比，炎症较重的PS中GPC4明显降低，而HS受影响较小。SDC4无显著差异。

还比较了不同斑块类型炎症程度较高的PS中糖萼分子的表达模式。与脆弱斑块和稳定斑块相比，GPC4和HS在初始斑块中表达最高，而SDC4在这些斑块类型中表达无差异（图3 A、B）。有趣的是，仅在脆弱的斑块切片中观察到糖萼分子与炎症程度较高的PS中CD68表达决定的局部炎症呈强烈负相关，而在初始斑块或稳定斑块切片中则没有观察到。这说明，糖萼成分的内皮表达取决于斑块易损性和局部炎症。

图3 GPC4 （A）和HS（B）在不同斑块类型切片中的表达比较。

该研究在体外和体内证明了不同糖萼分子在内皮细胞中表达的特点。动态粘附测定显示，GPC4在动脉粥样硬化发生的早期阶段通过减弱免疫细胞对EC的早期粘附而具有潜在作用。GPC4和HS在人动脉粥样硬化病变中的独特表达突出了对炎症和斑块易损性的影响。虽然需要进一步的研究来阐明不同的机制，但上述数据表明内皮糖萼在心血管疾病中的临床意义。

参考文献：Urschel K, Hug KP, Zuo H, Büttner M, Furtmair R, Kuehn C, Stumpfe FM, Botos B, Achenbach S, Yuan Y, Dietel B, Tauchi M. The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2023 Jul 18;24(14):11595. doi: 10.3390/ijms241411595. PMID: 37511353; PMCID: PMC10380765.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37511353/

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